ゼブラフィッシュ放射状グリア前駆細胞におけるNotch/DeltaDシグナル伝達のイメージングのための抗体取り込みアッセイ

要約

出典:Zhao, X. et al., ゼブラフィッシュ放射状グリア前駆細胞の非対称分裂中のノッチ/デルタエンドサイトーシスを追跡するための抗体取り込みアッセイ。J. Vis. Exp. (2023年)

このビデオは、ゼブラフィッシュの放射状グリア前駆細胞におけるNotch/DeltaDシグナル伝達を画像化するための抗体取り込みアッセイを示しています。これには、アガロース包埋デコレーションゼブラフィッシュ胚のマウント、RGP上のDeltaDリガンドを標的とする色素溶液の注入、および蛍光顕微鏡下でのイメージングによる非対称細胞分裂のNotch/DeltaDシグナル伝達活性化の確認が含まれます。

プロトコル

1. ゼブラフィッシュ胚の準備

1. 午後5:00 pm前に、雌の野生魚1匹と雄のTg [ef1a:Myr-Tdtomato]魚1匹を、仕切りを使用して各水槽に分離することにより、魚の横断水槽を設置します。
2. 翌朝の午前11:00までに、すべての交差点のタンクから仕切りを取り外してください。静かにし、魚が交尾している間は魚の邪魔をしないでください。通常、ディバイダーを取り外してから30分以内にスポーンが発生します。受精卵はタンクの底に残ります。
   1. メッシュフィルターでタンクから受精卵を収集します。卵を卵水で満たされたペトリ皿に洗い流して移し、10倍から20倍の倍率で解剖顕微鏡で胚を検査します。
3. 受精した胚を、約20mLの胚培地(100mLの1,000倍ストック溶液には29.4gの塩化ナトリウム(NaCl)、1.27gの塩化カリウム(KCl)、4.85gの塩化カルシウム、二水和物(CaCl_{2.2H 2O})、および8.13gの硫酸マグネシウム七水和物(MgSO_{4.7H 2}O)と大口径ガラスパスツールピペット。胚を28°Cに保ちます。ペトリ皿ごとに50個の受精胚を30mLの胚培地で28.5°Cに保ちます。
   注:通常、1組の魚は100〜300個の胚を産み、健康な胚の受精率と生存率は交配ごとに95%を超えます。
4. 翌朝、胚が受精後~18-20時間(hpf)の発達段階に達した午前8:00にインキュベーターから胚を取り出します。落射蛍光顕微鏡で20倍の倍率で観察し、最初は白色光を使用します。そのとき、ゼブラフィッシュの胚は20体節の段階にあります。
   1. 曇っているか破裂した死んだ胚は、ガラスピペットを使用して顕微鏡で廃棄します。
5. 蛍光灯をオンにし、顕微鏡の赤色蛍光タンパク質(RFP)フィルター設定を選択します。次に、強い赤色蛍光を持つ胚を選択し、卵水で新しい皿に移します。
   1. 白色光の下で、2つの細かい鉗子(鉗子の先端は鋭く、損傷を受けていない必要があります)を使用して、胚を手動で脱角化します(材料の表)。
   2. 1組の鉗子で絨毛膜を保持し、もう一方の鉗子で絨毛膜に裂け目を作ります。鉗子を使って慎重に裂け目を開き、他の鉗子の先端で胚を優しく押すことで、胚が通過するのに十分な大きさにします。
6. 脱角化した胚を新鮮な胚培地を入れた新しいペトリ皿に移し、マイクロインジェクションの前にすばやくすすぎます。

2. マイクロインジェクションの準備

1. キャピラリー(外径1.2mm(OD)、内径0.9mm(ID)、フィラメント付き)を使用して、プーラーで細い注射針を引っ張ります。ハンドブックに従って引っ張りプログラムを設計し、最適化します。
2. 立体解剖顕微鏡で鉗子で針の先端を開きます。先端の直径は10μm前後、テーパー角度は30°前後にします。
3. 注射前に、マウスモノクローナル抗Dld抗体を抗マウス-IgG-Atto647Nと結合させてください。
   1. 各注入実験について、0.5 μLの抗Dld抗体(0.5 mg/mL)と2 μLの抗Mouse-IgG-Atto647N抗体(1 mg/mL)を5〜10回ピペッティングして混合します。その後、室温で少なくとも30分間(または氷上で2〜3時間)インキュベートします。
   2. インキュベーション後、2.5 μLのブロッキングバッファー(10 mg/mLマウスIgG)と0.5 μLの0.5 μLの0.5%フェノールレッドを抗体混合物に加え、10回ピペットで十分に混合して、混合物に残っている未標識抗体をブロックします
      手記：各試験について、抗Dld抗体を含まない混合物を1つ追加で調製し、それを対照として使用します。
4. 胚培地に1%低融点アガロースを調製します。アガロース含有混合物を70°Cで、混合物が透明になるまで加熱します。
   1. アガロース溶液を2mLの微量遠心チューブに分注します。アリコートを~40°Cのヒートブロックに保ちます。
5. 1%低融点アガロースを含むチューブ内で胚を3秒間すすぎます。
6. 図1に示すように、胚を逆さまのプラスチック製のペトリ皿の蓋に置き、個々のアガロース(~30-40μL)と一緒に蓋に取り付けます。胚をアガロース内で横方向に平らに置き、アガロースが室温で固まるまでこの位置を維持します。
7. 上記のように、12個の胚を3列に1つずつマウントします。アガロースにマウントされたすべての胚を卵培地で覆います。

3. マイクロインジェクション

1. 埋め込まれた胚を実体顕微鏡の下に置き、アガロースを卵水で覆います。
2. 図1に示すように、空気圧インジェクターとマイクロマニピュレーターを顕微鏡の近くに置きます。空気資源として、高圧下の窒素ガス(_N2)を含む鋼製ガスボンベを使用してください。
   1. 胚がアガロースに取り付けられた後にのみ、ガスバルブを開いてください。次に、マイクロインジェクターのフロントフィルモジュールを使用する場合は、図1に示すように、調製したガラス針に2 μLの抗体混合物をマイクロマニピュレーターにフロントロードします。
   2. 入力圧力を ~80-90 psi に、射出圧力を ~20 psi に調整します。
3. 前述のように、顕微鏡下のマイクロメーターを使用して注入量を校正します。針の開口部のサイズに応じて、チューニング時間の持続時間を10ミリ秒から120ミリ秒に設定します。パドルを軽くたたいて、注入の各パルスを送達します。各送液の注入量を ~4-5 nL に調整します。
4. マイクロインジェクション針の先端を後脳の後方の背側屋根板からr0/r1ヒンジポイントまで突き刺し、脳組織に当たらないように約10nL(2パルスまたは3パルス)の抗体混合物を注入します。脳室内の赤い液体の流れを観察します。
   手記：後脳室は、中脳後脳境界の後方にあります。注入されたフェノールレッド含有抗体混合物は、脳脊髄液と拡散することで、後脳から前脳まですぐに脳室を満たします。
5. 注入後、マイクロマニピュレーターのつまみを回して、素早く針の先端を胚から取り出します。注射を成功させるためには、注入された混合物の赤色の色素が、周囲のアガロースに漏れることなく、脳室に安定して留まります。
6. 顕微鏡下でマウントプレートを動かして、リピートに適した位置に別のマウントされた胚を見つけます。
   1. 6〜8個の胚を注入した後、顕微手術用ナイフでアガロースを剥がし、埋め込まれたアガロースから胚を解放します。マイクロインジェクションした胚を30 mLの胚培地を入れた新鮮な皿に移し、次のステップのために室温で置きます。

4. マウントとタイムラプスライブイメージング

1. 30分後、選択した胚を10mLの胚培地に移します。420 μLのトリカインストック(4 mg/mL)を10 mLの胚培地に加えて、胚を麻酔します。
2. 胚をマウントするには、チューブ内に同濃度のトリカインを含む0.8%低融点アガロースを調製します。アリコートを~40°Cのヒートブロックに保ちます。
3. ガラスピペットを使用して、注入した胚を温かいアガロースに3秒間浸します。次に、すぐに同じガラスピペットでアガロースから胚を取り出し、チューブからアガロースを一滴垂らして、胚を35 mmガラス底培養皿の中央に置きます。グラスに一滴につき1つの胚だけを置きます。
4. ファイバープローブまたはローディングチップで胚を優しく向き付け、胚の脳の背側をガラス底にできるだけ近づけます。胚の位置を穏やかに調整して、アガロースが徐々に固まるにつれて、胚がカールしないように伸ばします。
5. その後、ガラス底の皿を裏返して胚の位置を確認します。正しく取り付けられた胚を持つ背側の前脳全体が顕微鏡で見えることを確認してください。
6. トリカインを含む28.5°Cの予熱した胚培地を2〜3mL加えて、胚を覆います。図1に示すように、皿を共焦点顕微鏡の温度制御されたステージに適切に置きます。イメージングチャンバーの温度を28.5°Cに調整します。これで、胚をイメージングする準備が整いました。

結果

図1:実験ステップのフローチャート。MyR-Tdtomatoレポーターを発現させたトランスジェニックゼブラフィッシュは、1日目にAB野生型と交配されました。2日目には、赤色蛍光胚を選抜してマイクロインジェクションを行い、続いてタイムラプスイメージングを行います。2^日目の実験全体は約8時間かかります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35mmガラス底培養皿	株式会社MatTek	P35GC-1.5-10-C
空気圧インジェクター	成茂	IM300
抗マウスIgG-ATTO647N	シグマ・アルドリッチ	50185
CaCl2.2H2O	シグマ・アルドリッチ	C3306
キャピラリー、外径1.2 mm、内径0.9 mm、フィラメント付き	世界の精密機器	1B120F-6
CSU-W1 スピニングディスク/高速広視野	ニキン	該当なし	Nikon Ti 倒立蛍光顕微鏡 CSU-W1 広視野共焦点レンズ。
デュモンメディカルピンセットスタイル5	トーマス・サイエンティフィック	72877-D
フレーミングブラウンP897プーラー	サッターインストゥルメント	該当なし	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KClの	ミリポア	529552
MgSO4.7H2O	シグマ・アルドリッチ	M2773
マイクロマニピュレーター	世界の精密機器	WPI M3301R
マウスアンチDLD	アブカム	AB_1268496
ZenonのマウスIgGブロッキングバッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Z25008
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S3014
フェノールレッド	シグマ・アルドリッチ	P0290
ステミ 2000	ツァイス	該当なし
トリカイン	シグマ・アルドリッチ	E10521
UltraPureTM低融点アガロース	インビトゲン	16520050

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