植物組織におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの免疫局在

要約

出典:Costa, M., et al. 植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在。J. Vis. Exp.(2021年)。

このビデオは、アラビノガラクタンタンパク質(AGP)とペクチンを植物組織に局在させる免疫染色技術を示しています。固定および樹脂に包埋された植物組織切片を、AGP特異的およびペクチン特異的な一次抗体および蛍光二次抗体、およびセルロース結合性蛍光色素で染色し、細胞壁におけるそれらの組織特異的な共局在を明らかにします。

プロトコル

1. 免疫局在

>注:蛍光免疫局在化手順は、2つの抗体の連続的な使用に依存しています。一次抗体は、特定の標的抗原に対して産生されます。二次抗体は一次抗体に対して特異的に産生され、蛍光法のために蛍光色素(この特定のプロトコルではFITC[フルオレセインイソチオシアネート])に結合されます。一次抗体は、サンプル中の標的抗原を検出するために使用され、二次抗体は、過剰な一次抗体を洗い流した後、一次抗体がサンプルに結合した場所をマークするために使用されます。コントロールはこのアッセイの重要な部分であり、観察の精度を保証するために常に実行する必要があります。スライド上の1ウェルは、ネガティブコントロールとして使用するために予約しておくべきであり、一次抗体治療はスキップされるため、実験の終了時にはシグナルが観察されません。ポジティブコントロールは、標識がすでに知られており確実な抗体でウェルを処理することにより、実験に含める必要があります。ポジティブコントロールは二次抗体の標識効果と反応条件を確認するために使用され、ネガティブコントロールは二次抗体の特異性を試験します。

1. ピペットチップボックスの底に湿らせたペーパータオルを置き、スズ箔で包んでインキュベーションチャンバーを準備します(図1B-1E)。スライドをインキュベーションチャンバーに入れます。
2. ブロッキング溶液(1 Mリン酸緩衝生理食塩水[PBS]中の5%脱脂粉乳(w/v))の8 mmウェルあたり50 μL滴をピペットで取り、10分間インキュベートします。ブロッキング溶液を取り外し、すべてのウェルをPBSで10分間2回洗浄します。
3. 一次抗体溶液(表1参照)を調製し、ブロッキング溶液中の1:5(v/v)抗体を調製し、8 mmウェルあたり約40 μL
   と見積もってください。 手記： 抗体の濃度は、製造元のプロトコルに従って調整する必要があります。
4. 再蒸留水(ddH₂O)で5分間最終洗浄を行い、ウェルを完全に乾かさないでください。
5. 一次抗体溶液を反応ウェルにピペットで移します。コントロールウェルへのピペットブロッキング溶液。
6. インキュベーションチャンバーを閉じ、室温で2時間放置した後、4°Cで一晩放置します。二次抗体溶液をブロッキング溶液(v / v)に1%調製し、ウェルあたり約40μLです。錫箔で覆ってください。
7. すべてのウェルをPBSで10分間2回洗浄し、続いてddH₂Oでさらに10分間洗浄します。ブロッキング溶液や堆積物の痕跡がウェルに見えないことを確認します。
8. 二次抗体溶液をすべてのウェルにピペットで移します。これからは、滑り台を光から守ってください。
9. 暗所で室温で3〜4時間インキュベートします。
10. すべてのウェルをPBSで10分間2回洗浄し、続いてddH₂Oでさらに10分間洗浄します。
11. 各ウェルにcalcofluor(1:10,000(w / v)蛍光灯28 in PBS)を一滴塗布します。洗浄せずに、封入剤を一滴垂らし(材料表を参照)、カバースリップを敷きます(図2H)。
12. 10x/0.45、20x/0.75、40x/0.95、100x/1.40レンズを装備した蛍光顕微鏡で観察し、UV(calcofluor染色用)フィルターとFITCフィルターを使用して、それぞれ細胞壁と免疫局在を検出します(図2I)。UVの場合は励起/発光(nm)358/461、FITCの場合は485/530の波長を使用してください。
13. 結果をより視覚化するには、両方の画像をImageJなどと重ね合わせます。

>表1:有用なモノクローナル抗体のリスト。 上記の表は、利用可能な抗体の一例であり、そのターゲットに関する情報と購入可能な場所を示しています。

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名前	親近感	販売場所
LM2	アラビノガラクタンタンパク質	Plant probes (リーズ、英国)
LM5	ペクチン
LM6	アラビナン
LM7	ホモガラクツロナン
LM8	キシロガラクツロナン
LM13	(1-5)-A-L-アラビナン
LM14	アラビノガラクタンタンパク質
LM16	加工アラビナン - RG-I
LM18	ホモガラクツロナン
LM19	ホモガラクツロナン
LM20	ホモガラクツロナン
LM26	ブランチギャラクタン
LM30	アラビノガラクタンタンパク質
JIM5	低メチルエステル化ホモガラクツロナン	CCRC (ジョージア州、米国)
JIM7	高メチルエステル化ホモガラクツロナン
JIM4	アラビノガラクタンタンパク質
JIM8	アラビノガラクタンタンパク質
JIM13	アラビノガラクタンタンパク質
JIM15	アラビノガラクタンタンパク質
JIM16	アラビノガラクタンタンパク質
JIM20	エクステンシン
MAC207	アラビノガラクタンタンパク質

結果

図 1.(A)ウルトラミクロトームで切片化するためのサンプル(Yellowブロック)を調製するためのブロックトリミングシーケンスの概略図。まず、ゼラチンカプセルを取り出します(1)。次に、最初にカプセルの側面に対してサンプルに接する方向に40°から45°の角度でトリミングされ(2)、最初のカット(3)の90°で2番目のカットが行われ、続いて同じルール(5)に従って3番目(4)と4番目がカットされます。このトリミングの最初のフェーズから、頂上がサンプルの上にあるピラミッド型の構造が得られます。最後に、鋭利な刃で山頂をレジンブロックの主軸に対して垂直に削り取り、埋め込まれたサンプルに到達します。手順の最後に、正方形または台形の表面を取得する必要があります(6)。(B)インキュベーションチャンバーを作るために必要な備品。錫箔(1)、両面ダクトテープ(2)、ペーパータオル(3)、ピペットチップボックス。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
8ウェルガラス反応スライド	マリンフェルド	MARI1216750	他のブランドを使用することもできます
抗ラットIgG(wole分子)-FITC抗体のヤギ産生	シグマ・アルドリッチ	F6258
カバースリップ、24 mm x 50 mm	マリンフェルド	MARI0100222	カバースリップはすべてのウェルを覆う必要があります。他のブランドを使用することもできます
ddHの2O	な	な
エタノールアブソリュート	な	な
蛍光増白剤28	シグマ・アルドリッチ	F-6259
無脂肪粉乳	ネスレ	な	無脂肪粉乳で十分です
オーブン	な	な	ジェネリック実験用オーブン
ラット生成モノクローナル抗体	植物プローブ	な	細胞壁の成分を認識するいくつかの抗体は、Complex Carbohydrate Research Center(CCRC、米国ジョージア大学)とPlant Probes(Paul Knox Cell Wall Lab、英国リーズ大学)の両方で入手できます。一般的に使用されるMABSの短いリストと、それらが購入できる場所は、補足表1に示されています
UVおよびFITC蛍光フィルターを備えた正立落射蛍光顕微鏡	ライカ菌類	DMLbの
真空チャンバー	な	な
真空ポンプ	な	な
ベクタシールド	vectaラボ	T-1000	他の退色防止剤を使用することもできます。FITCおよび蛍光ブライトナー28との互換性を確認してください。(注:非商用の代替品については、(Jonhson et al 198218を参照)25 mg/mLの1,4-ジアゾビシクロ-(2,2,2)オクタン(DABCO)を9:1(v / v)グリセロールに1xPBSに混合することにより、退色防止培地を作製できます。希釈したHClでpHを8.6に調整します。