サンドイッチELISAを使用したワクチン中の免疫原性糖タンパク質含有量の測定

要約

出典:Jallet, C. et al., 狂犬病ワクチンの効力を評価するためのIn Vitro ELISA試験。J. Vis. Exp. (2020年度)

このビデオでは、ワクチン中の免疫原性糖タンパク質レベルを評価するために設計された間接的な酵素結合免疫吸着アッセイまたはELISAサンドイッチ免疫捕捉アッセイを紹介しています。糖タンパク質特異的抗体を含むアッセイプレートを、参照ワクチンや試験ワクチンなどの段階希釈ワクチンサンプルとインキュベートし、続いてイムノアッセイを行い、試験ワクチン中の糖タンパク質含有量を定量します。

プロトコル

>1. セキュリティ上の注意

>注:この方法は、生狂犬病ウイルス(RABV)と不活化ワクチンの両方に適用できます。

1. 適切な実験室の実践と安全手順を使用してください。
2. 使い捨てコート、手袋、マスク、眼鏡などを含む適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。
3. 生きたウイルスが滴定されたら、クラスIIの生物学的安全キャビネットを使用してください。
   1. サンプルと接触する物質(試薬、洗浄液など)は感染性物質とお考えください。
   2. 汚染された物質を漂白剤溶液(次亜塩素酸ナトリウムの2,5%)に30分間浸して除染することにより、汚染された物質を処理します。
4. 化学物質は、優れた実験室の慣行に従って取り扱ってください。

>2. 事前準備

1. 可能な限り分析グレードの試薬を使用してください。
2. コーティングバッファー/炭酸塩バッファー、パッシベーションバッファー、希釈剤、およびクエン酸バッファー(表1)の新鮮な溶液を調製し、0.45または0.22μmフィルターでろ過し、使用前に4°Cで1日間保存して分析純度を維持します。
3. 使用の30分前に試薬を室温(+18°C〜+25°C)に到達させ、使用前に穏やかに混合して均質化します。

>3. マイクロプレートの感作

>注:大量の免疫グロブリンに結合するように最適化された96ウェル吸着免疫測定プレートを使用してください(例:材料の表を参照)。

1. 各ウェルに、炭酸バッファーで希釈したモノクローナル抗体(mAb-D1)200 μLを加えます
   手記：約1 μg/mLの最適濃度が実験的に決定されており、精製したmAb-D1の約1/2000希釈に相当します。この推奨濃度は、各mAb-D1バッチで示されており、ポジティブコントロールで定期的に検証する必要があります。
2. プレートを粘着フィルムで覆い、加湿雰囲気下でマイクロプレートを37°Cで3時間インキュベートします。
3. ウェルの内容物を慎重に吸引し、2,5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。
4. マイクロプレートを裏返し、吸収紙の上で室温で5分間乾燥させます。

4. マイクロプレートの不動態化

1. 各ウェルに、パッシベーションバッファー300μLを加えます。
2. プレートを接着フィルムで覆い、37°Cで30分間インキュベー
トします。
3. 慎重に吸引し、ウェルの内容物を2,5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。
4. マイクロプレートを反転させ、吸収紙の上で室温で1分間乾燥させます
   手記：マイクロプレートはすぐに使用することも、-20°Cで密封して使用まで最大3か月間保存することもできます。

5. ELISAアッセイ

>注:参照ワクチンの管理曲線を確立するために、ステップ5.3は必要ありません。テストしたワクチンを滴定するには、ステップ5.1から5.6のすべてが必要です。

1. 増感マイクロプレートの洗浄
   1. 各ウェルに300 μLの洗浄バッファーを加えます。
   2. 慎重に吸引し、ウェルの内容物を2,5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。
   3. 手順5.1.1と5.1.2をさらに5回繰り返して、増感プレートを広範囲に洗浄します。
   4. マイクロプレートを反転させ、吸着紙の上で室温で1分間乾燥させます。
2. 対照曲線の参照ワクチンの希釈
   1. 参照ワクチン(検証抗原Lot 09)を、10 μg/mLの狂犬病ウイルス糖タンパク質の濃度に対応する1 mLの蒸留水に再構成します。.
   2. 希釈液中で再構成した参照ワクチンを10倍に希釈して調製し、1 μg/mLの狂犬病ウイルス糖タンパク質に到達させます。
   3. 表1に示すように、この参照ワクチンの6回の連続2倍希釈液を希釈液で調製します。
   4. 200 μLの希釈剤を二重に分配し(ウェル1H/2H)、ブランクコントロールとして使用します。
   5. 各参照ワクチン希釈液のウェルあたり200 μLを二重に分配します(ウェルG1/G2からA1/A2)。
3. 試験したワクチンの滴定のための希釈液
   1. 試験したワクチンを希釈液中で10倍に希釈して調製します。
   2. 表2に示すように、試験したワクチンを希釈液中で7回2倍段階希釈液で調製します。
   3. 試験した各ワクチン希釈液(ウェルH3/H4からA3/A4)のウェルあたり200 μLを二重に分配します。
4. ELISAプレートのインキュベーション/洗浄
   1. マイクロプレートを接着フィルムで覆い、37°Cで1時間インキュベー
   トします。
   2. フィルムをはがし、慎重に吸引し、各ウェルの内容物を2,5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。
   3. 各ウェルに300 μLの洗浄バッファーを加えます。
   4. 慎重に吸引し、各ウェルの内容物を2,5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。
   5. ステップ5.4.3と5.4.4を5回繰り返して、未結合の抗原を除去し、コーティングされた抗体(mAb D1)に結合したGタンパク質三量体を保存します。
   6. マイクロプレートを裏返し、吸収紙の上で室温で1分間乾燥させます。
5. ペルオキシダーゼ標識mAb-D1の結合
   1. ペルオキシダーゼ標識mAb-D1の推奨希釈倍率(1/2000)のウェルあたり200 μLを希釈液(約1 μg/mL)に分配します。推奨濃度は各mAb-D1バッチで示されており、ポジティブコントロールで定期的に検証する必要があります。
   2. マイクロプレートを接着フィルムで覆い、37°Cで1時間インキュベー
   トします。
   3. フィルムをはがし、慎重に吸引し、各ウェルの内容物を2,5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。
   4. 各ウェルに300μLの洗浄バッファーを加えます。
   5. 慎重に吸引し、各ウェルの内容物を2,5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を含むレシピエントに移します。
   6. ステップ 5.5.4 と 5.5.5 を 5 回繰り返して、未結合のペルオキシダーゼ標識抗体 (mAb D1) を除去します。
   7. マイクロプレートを裏返し、吸収紙の上で室温で1分間乾燥させます。
6. 基質-発色剤を用いた啓示
   1. 基質-発色剤溶液のウェルあたり200μLを分配します。
   2. マイクロプレートをフィルムで密封し、室温で30分間暗所でインキュベートします。黄橙色は、結合したペルオキシダーゼ標識抗体(mAb D1)の量に比例する強度で発生します。
   3. ウェルあたり50μLの停止溶液を加えて反応を停止します。
   4. マイクロプレートの底部を慎重に拭き、分光光度計にセットして、使用済みのすべてのウェル(ネガティブコントロール(ブランク)、参照ワクチン、および試験済みワクチン)の492 nmでの光学濃度(OD)を決定します。
   5. 解析のために OD データを .xls または .xlsx ファイル形式で収集します。

>表 1.アッセイで使用されるバッファー。

ます )

バッファーと試薬	準備
コーティングバッファー (炭酸塩緩衝液 50mM pH=9.6)	炭酸ナトリウム50 mM(Na 2 CO 3-10H 2 O)を重炭酸ナトリウム50 mM(Na2CO3-10H 2O)を、目的のpH(重炭酸ナトリウムの約1/10体積)になるまで加え
パッシベーションバッファー	0.3% ウシ血清アルブミン (BSA、フラクション V)、5% スクロース、炭酸塩緩衝液 50 mM pH 9.6
10x リン酸緩衝生理食塩水 pH=7 (PBS 10x)	NaCl 80 g、KCl 2 g、Na2PO 4-12H2O 11.33 g、KH2PO4 2g 1Lの蒸留水中。4N NaOHでpH=7を調整
洗浄バッファー	0.05% Tween (1x PBS)
希釈 剤	0.5% ウシ血清アルブミン (フラクション V)、0.05% Tween in 1x PBS (BSA による酸性化のため pH を 7 に調整
クエン酸緩衝液 pH-5.6 (ペルオキシダーゼ基質用)	11.67 gクエン酸三ナトリウム-2H2O(Na3C6H5O7-2H 20)、2.17 gクエン酸-1H20 1Lの蒸留水
基質-発色剤溶液	50 mg オルトフェニレンジアミン錠、0.1% 過酸化水素 30% (110 vol)、25 ml クエン酸緩衝液 pH 5.6
ソリューションを停止しています (4N硫酸)	80mlの冷却蒸留水に10mlのH2SO4 36N。希釈は氷浴で行う必要があります

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
クラスII生物学的安全キャビネット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10445753	生きたウイルスを滴定する場合
透明な平底免疫非滅菌96ウェルプレート、400 μL、MAXISORP	サーモフィッシャーサイエンティフィック	439454	ロードされた抗体への結合に適しています
Equip Labo ポリプロピレンラボ用ヒュームフード	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12576606	硫酸の調製に
免疫プレート Strong 吸着MAXISORP フラットボトム 井戸F96	ダッチャー	55303	ロードされた抗体への結合に適しています
マイクロプレートシールテープ(100枚)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15036
マイクロプレート シングルモード リーダー Sunrise	テカン
マイクロプレートシェーカーインキュベーター	ダッチャー	441504
マイクロプレート洗浄機 Wellwash	サーモフィッシャーサイエンティフィック	5165000
マルチチャンネルピペット(30-300μL)12チャンネル	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4661180N
シングルチャンネルピペット (キット 2 : フィンピペット F2 0.2-2 μL micro, 2-20 μL, 20-200 μL & 100-1000 μL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	4700880