アレルゲン特異的免疫グロブリンEのマイクロ流体カートリッジベースの検出システム

要約

出典:Huang, Z., et al. 血清アレルゲン特異的免疫グロブリンE（sIgE）を検出するためのバイオチップマイクロ流体技術の応用。J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、マイクロ流体カートリッジベースの化学発光システムを使用して血清特異的免疫グロブリンEを検出するためのプロトコルを示しています。血清IgEは、カートリッジの反応ゾーンに固定化された異なるアレルゲンと相互作用し、その後、ペルオキシダーゼ標識抗IgE抗体と化学発光基質で検出されるため、複数のアレルゲン特異的IgEを同時に検出できます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

>1. 勉強会の基本情報

>注:州呼吸器疾患研究所(AIR-SKLRD)のアレルギー情報リポジトリは、広州呼吸器病院研究所(GIRH)内に設立された大規模な血清バンクです。過去10年間に開始されたAIR-SKLRDは、すでにアレルギー疾患患者からの血清サンプルとその臨床情報の収集と保存を開始しています(表1)。現在の研究は、AIR-SKLRDの血清を用いて実施されました。

1. AIR-SKLRDのデータベースで2015年1月から2018年6月までに採取された血清を検索し、その地域で一般的なアレルゲンに感受性があることが判明したアレルギー疾患患者を選択してください。
2. 選択されたすべての患者がアレルギー性鼻炎や喘息、アレルギー性皮膚炎、および/または蕁麻疹などのアレルギー関連疾患を患っていること、およびこれらの患者の血清に、この領域の一般的なアレルゲンの複数の血清アレルゲン特異的免疫グロブリンE(sIgE)感作が含まれていることを確認してくださいシステム1によって検出されます。
3. 医療記録が不完全な患者、追跡調査ができない患者、科学目的での血清サンプルの使用についてインフォームドコンセントを拒否する患者、免疫不全が特定された患者、現在免疫療法または免疫調節剤を服用している患者、または寄生虫感染症にかかっていることが判明した患者を除外します。
4. 検査所見への干渉を最小限に抑えるために、血清採取前に治療や薬物の処方が行われていないことを確認してください。基準を満たさなかった血清サンプルはすべて拒否されました。

2. 関心のあるフローと測定値の調査

>注:マイクロ流体システムでは、19のアレルゲンを測定するために100μLの血清が必要です。静脈血(5 mL)は、分離ゲルを含む真空血管を使用して各患者から採取されました。1,000 x gで10分間遠心分離した後、上層を採取して試験しました。未使用の血清は-80°Cで保存した。試験前に、血清を室温で30分間保持し、ボルテックスミキサーで振とうした。凍結と融解の繰り返しのサイクルは回避されました。

1. 主に、Dermatophagoides pteronyssinus (d1)、Dermatophagoides farinae (d2)、Blomia tropicalis (d201)、ネコのフケ (e1)、イヌのフケ (e5)、バミューダグラス (g2)、チモシーグラス (g6)、ゴキブリ (i6)、アスペルギルス・フミガータス (m3)、カンジダ・アルビカンスの sIgE から全アレルゲンまでの血清サンプルを試験します(M5)、ブタクサ(W1)、卵白(F1)、牛乳(F2)、小麦(F4)、ピーナッツ(F13)、大豆(F14)、アーモンド(F20)、カニ(F23)、エビ(F24)。セクション3.
   に記載されている指示に従ってください 注:sIgEの測定は、アレルゲン特異的IgEアッセイキット(材料の表を参照)を用いて行い、化学発光分析装置で測定しました。
2. 再現性試験に十分な血清(900μL以上)を含むサンプルの中から3つのサンプルをランダムに選択します。すべての条件を変えずに、3つの血清でアレルゲンsIgEを9日間連続して毎日測定します(つまり、100 x 9 = 900 μLの血清)。

3. マイクロ流体システムの半自動試験手順

>注:システム2は、自動マイクロ流体技術、タンパク質マイクロアレイ、冷光分析、並列IgE分析、および画像処理技術を統合しています。試験プロトコルは、装置の準備、サンプルのローディング、インキュベーション、測定の4つの部分に分かれています。

1. 機器の準備
   1. PCとアナライザーの電源を入れます.
      手記：電源スイッチはベースの左側にあります。
   2. PCでLabITプログラムを起動します。ダークフレーム警告ウィンドウが表示されたら、[OK]をクリックしてLEAKテストを実行します。その後、中央のロゴをクリックして操作インターフェースに入ります.
      手記：システムは、24時間以上アイドル状態が続く場合は、LEAKテストを実行するようにユーザーに通知します。
   3. 画面の右下隅にある反応温度とCCD(電荷結合素子)温度を確認してください。反応温度は約10分で37°C±1°Cに上昇し、CCD温度は1°C±-15°Cに低下します。
   4. CCD温度が-15°C±1°Cに下がった後にLEAKテストを実行します。LEAKテストを実行する前に、機器内に他のアイテムが残っていないことを確認し、ドアを閉めてください。[ツール] メニューの [システム テスト] の [リーク テスト] をクリックします。テスト中はドアを開けないでください。テストが終了すると、レポートウィンドウがポップアップ表示されます。
2. サンプルローディング
   1. 620 μLの洗浄バッファー、120 μLのブロッキングバッファー、60 μLのコンジュゲートAおよびB、60 μLの基質AおよびB、および100 μLの血清サンプルを、マイクロ流体カートリッジの対応する試薬タンクに加えます。
3. 潜伏
   1. [カートリッジID]をクリックし、バーコードスキャナーを使用してカートリッジのシリアル番号をスキャンし、サンプルIDを入力し、カートリッジをアナライザーに入れ、ドアを閉じ、[アナライザー]と[実行]をクリックして分析を開始します。
4. 測定
   1. 測定後に結果を統計ソフトウェア(Excelなど)にエクスポートします.
      注:30分間のインキュベーション後、分析装置は自動的に測定を行い、結果を報告します。

>表 1: 患者の人口統計学的特性。合計で 293 人の被験者が選択基準を満たし、年齢の中央値は 23 歳 (8 歳から 36 歳までの四分位範囲) でした。そのうち、男性は170人(58.02%)、女性は123人(41.98%)でした。また、アレルギー性鼻炎が92人(31.40%)、アレルギー性喘息が117人(39.93%)、鼻炎と喘息が併存しているのが36人(12.29%)、食物アレルギーや皮膚アレルギーなど他のアレルギー疾患が48人(16.38%)でした。

歳

特性	番号(%)
性別、n(%)
女性	123名(41.98%)
男性	170(58.02%)
年齢、年、n(%)
中央値(25%、75%)	23(8,36)
≤10	97(33.11%)
11-20	37(12.63%)
21〜40	101(34.47%)
>41	58(19.80%)
診断、n(%)
アレルギー性鼻炎	92(31.40%)
アレルギー性喘息	117名(39.93%)
喘息を伴うアレルギー性鼻炎	36(12.29%)
余人	48(16.38%)

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Agnitio BioIC アナライザー	Agnitio Science & Technology(台湾、中国)	BA-G2000
BioICアレルゲン特異的-IgE検出キット	Agnitio Science & Technology(台湾、中国)	DR17A12
BioIC カートリッジ配置プレート	Agnitio Science & Technology(台湾、中国)	T20セット
BioIC試薬ディスペンサー	Agnitio Science & Technology(台湾、中国)	DS-1
画像2次元バーコードマシン	Agnitio Science & Technology(台湾、中国)	NLS-HR200
VORTEX-5ボルテックスミキサー	Haimen Kylinbell Lab Lastruments Co., Ltd. (ハイメン・キリンベル・ラボ・ラストルメンツ)	ボルテックス-5