抗体特性評価のための細胞外小胞の免疫捕捉およびフローサイトメトリー(英語)

要約

出典:Arakelyan, A. et al., ビリオンおよび細胞外小胞の抗原スペクトルを分析するためのフローウイルスメトリー。J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオは、蛍光標識捕捉抗体-磁性ナノ粒子コンジュゲートを使用した細胞外小胞の免疫捕捉を示しています。このプロセスには、複雑な形成、蛍光標識検出抗体による染色、磁気分離、抗原特性評価のためのフローサイトメトリー分析が含まれます。

プロトコル

1. 磁性ナノ粒子(MNT)の結合

1. 市販のカップリング手順と試薬を使用して、MNPを抗体(ABS)(通常は1 mg)と結合します。カルボン酸を反応基とする酸化鉄ナノ粒子が用いられます。
   1. 抗体が0.5 mLを超える容量にある場合は、100K濃縮器を使用して濃縮してください。2,000 x gで3〜5分間遠心します。
2. 手順の最後に、10 μlのクエンチングバッファーを追加した後、MNPを12 mm x 75 mmのチューブに移し、3 mLの洗浄/保存バッファーを追加します。チューブを磁気セパレーターの中央の穴に置き、4°Cで一晩放置します。
3. すべてのMNPがチューブの側面に溜まったことを確認してから、すべての液体を慎重にピペートします。3 mlの新鮮な洗浄/保存バッファーを追加し、磁石に戻します。
4. 数時間後、MNPがチューブの側面に集まっているかどうかを確認し、液体をピペで取り出します。2 mLの洗浄/保存バッファーを使用してMNPを再懸濁し、4°Cで保存します。
5. 抗体がMNPに結合していることを確認するには、関連する蛍光Fab抗体フラグメント(例:セクション2で説明したようにマウスモノクローナル抗体を捕捉に使用する場合はヤギ抗マウス)で標識し、フローサイトメーターで実行します。

2. MNPに結合した抗体の標識

1. 1.5 mLの微量遠心チューブで、捕捉抗体のアイソタイプに特異的な60 μl(条件あたり)のMNPと5 μl(200 μg/mlの市販溶液)の標識Fabフラグメントを組み合わせます。
2. 室温(RT)で30分間インキュベートし、連続混合します。
3. 100K濃縮器を300 μlのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でプレウェットし、1,500 x gの微量遠心分離機で5分間遠心します。
4. 標識複合体を100Kカラムで精製します。ステップ2.2の混合物を1,500 x gの微量遠心分離機で5分間遠心し、200 μLのPBSで洗浄し、初期容量で回収します。

3. 標識されたAb-MNP複合体を使用して目的の粒子(細胞外小胞、EV)を捕捉

する

1. 標識済みMNPs 60 μl (3.9 x 10¹² particles) を EV 調製物 (100 μl) でインキュベートします。
   1. さまざまな方法でEVの準備をします。ここでは、ショ糖勾配でEVを精製するか、エキソソーム沈殿試薬を使用して血小板の少ない血漿からEVを収集するか、血漿から直接分離します
      手記：最適な比率は実験ごとに決定する必要があり、調製中のEVの濃度に依存します。MNP-Ab 画分は、EV 画分の濃度と比較して ~10⁶ 過剰である必要があります。
2. EVの場合は、4°Cで1時間インキュベートします。
3. 2.5%マウスIgG /ヒトIgGを添加してFc結合をブロックし、穏やかにボルテックスし、RTで3〜5分間インキュベートします。
4. 各検出Absについて、メーカー推奨濃度または力価濃度を添加し、RTでさらに20分間インキュベー
トします。

>4. 磁気カラムを用いた非結合抗体からのMNP捕捉EVの分離

1. セパレーターマグネットに入れて使用する磁気分離カラムを作製します。
2. 500 μlの洗浄バッファー(2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBS)でカラムを事前に湿らせます。洗浄バッファーがカラムを流れるのを待ちます。
3. MNP-EV複合体をカラムに追加し、すべての液体が流れるようにします。500 μlの洗浄バッファーをカラムに加え、全容量を通過させます。
4. ウォッシュバッファーでさらに2回洗浄を繰り返します。
5. カラムを磁石から取り外し、12 mm x 75 mmのチューブに入れて、保持されたMNP-EV複合体を回収します。カラムを磁石から離れたチューブに3分間放置します。PBSを200 μl加え、ビーズを重力で流し、さらにPBSを200 μl加え、溶出後に4%パラホルムアルデヒド200 μlで固定します
   手記：パラホルムアルデヒドは発がん性が疑われる物質であり、換気されたフードで取り扱われ、手袋を着用する必要があります。
6. 単一のEVを定量するには、ハイスループットサンプラー(HTS)の容積設定を使用するか、取得の直前に、十分に混合されたフローサイトメトリーカウントビーズを追加します。

>5. フローサイトメーターによるMNPs捕捉EVの解析

1. フローサイトメーターを30分間ウォームアップします。
2. 品質管理ビーズを実行します。
3. MNPまたは標識されたEVの蛍光の閾値を設定します。しきい値に0.22μmのフィルタリングされたPBSを使用して、バックグラウンドの「ノイズ」を減らします。フィルタリングされたPBSがイベントを与えないか、または非常に少ないレベルでPMT電圧を調整することにより、しきい値を設定します。
4. 低域でサンプルを実行します。(標準の0.2 μmシースフィルターの後ろに直列に配置されたシース液には、追加の0.04 μmインラインフィルターを使用して、誤ったイベントをさらに排除します)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
料
カルボキシル磁性酸化鉄ナノ粒子結合キット	オーシャンナノテク	ICK-15-005
Amicon Ultra-4遠心フィルターユニット、Ultracel-100メンブレン付き	ミリポア	UFC810024
5mL丸底PP試験管、キャップなし	隼	352002
DEPC 処理水	品質、生物学的	〒351-068-131
SuperMAG-01 マグネティックセパレーター	オーシャンナノテク	スーパーマグ-01
Zenon R-PhycoerythrinマウスIgG1ラベリングキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	Z25055
Omega Membrane 100kを用いたNanosep遠心分離装置	ポール・コーポレーション	OD100C34
EDTAの0.5M	コーニングセルグロ	46-034-CIの
ウシ血清アルブミン溶液	シグマ・アルドリッチ	A9576-50ミリリットル
PBSの	ギブコ	10010-23
パラホルムアルデヒド、EMグレード、精製	EMSの	15710
123カウントeビーズ	eバイオサイエンス	01-1234-42
CytoCountビーズ	ダコ	S2366
アキュチェックカウントビーズ	インビトゲン	基板100
サイトメーターセットアップ&トラッキングビーズキット(CST)	BDバイオサイエンス	642412
備品
μMACSカラム	ミルテニーバイオテック	〒130-042-701
OctoMACSセパレーターマグネット	ミルテニーバイオテック	〒130-042-108
ナノドロップ	サーモフィッシャー	何一つ
ナノサイトNS300	マルバーン	何一つ
BD LSRIIフローサイトメーター	BDバイオサイエンス	何一つ
ソフトウェア
Flowjoソフトウェア	フロージョ
BD FACSDiva ソフトウェア	BDの