複数のサイトカインターゲットを定量するためのマルチプレックスビーズベースのイムノアッセイ

1. 生体試料調製

>注:選択された解剖学的部位と採血量は、各研究者の裁量に委ねられており、アッセイの結果に影響を与えることはありません。ただし、サンプルを取得したら、以下の手順に従ってサンプルを取り扱う必要があります。

1. 血清サンプルの調製
   1. 所望の量の血液を好ましい採取チューブに集め、少なくとも30分間凝固させます。
   2. サンプルを室温で1,000 x gで10分間遠心分離します。
   3. 血清とアッセイを直ちに取り出すか、ポリプロピレン製微量遠心チューブに分注し、サンプルを≤-20°Cで保存してください。
2. 血漿サンプルの調製
   1. エチレンジアミン四酢酸(EDTA)でコーティングされた採血管を使用して、必要な量の血液を採取します。
   2. 採取後30分以内に、室温で1,000 x gで10分間遠心分離します。
   3. 血漿を直ちに取り出してアッセイするか、ポリプロピレン製微量遠心チューブに分注してサンプルを≤-20°Cで保存してください。
3. 組織培養上清サンプルの調製
   1. サンプルを1,500 x g、4°Cで10分間遠心分離し、細胞と破片を除去します。
   2. 上清を採取してすぐにアッセイするか、ポリプロピレン製微量遠心チューブに分注して≤-20°Cで保存してください。
4. 凍結した生体試料の解凍
   1. 以前に凍結した生物学的サンプルは、使用前に氷と渦で短時間完全に解凍します。凍結融解サイクルを2回以上避けてください.
      手記：このプロトコールで使用したサンプルは、BALB/cマウス脾細胞(1 x 10⁶細胞、37°C+5%CO₂、さまざまな条件下で)を培養することによって得られました:非刺激、LPS(100 ng/mL)、αCD3(1 μg/mLプレートコーティング)+αCD28(1 μg/mL可溶性)、PMA(20 ng/mL)+イオノマイシン(500 ng/mL)。培養上清を48時間後に回収し、セクション1.3に記載のとおりに処理した。

2. 試薬の調製

1. プレミックス抗体固定化ビーズの調製
   1. 予め混合したビーズボトルを室温のソニケーターバスで1分間超音波処理し、次に使用前に30秒間ボルテックスします。ソニケーターバスが利用できない場合は、渦時間を1分に増やします。
2. 洗浄バッファーの調製
   1. キットに付属の20x Wash Buffer(20x PBS、1% Tween-20)を室温およびボルテックスに持ち込み、すべての塩分を溶液に取り込みます。
   2. 25 mLの20倍ウォッシュバッファーを475 mLの脱イオン水で希釈します。未使用部分は2°Cから8°Cの間で最大1か月間保管してください。
3. マトリックスBの調製(血清および血漿サンプルのみ使用)
   1. キットに含まれているアッセイバッファー(PBS、1% BSA)を凍結乾燥マトリックスBの入ったボトルに5.0mLを加え、少なくとも15分間完全に再構成した後、ボルテックスでよく混合します。残った再構成マトリックスBは、≤-70°Cで最大1ヶ月間保存できます。

3. 標準的な準備

注:このパネルの各分析物は、10,000 pg/mLの最高標準濃度を持っています。

1. 250 μLのAssay Bufferを添加し、凍結乾燥したMouse Th Cytokine Standard Cocktailを再構成します。短時間ボルテックスして混合し、バイアルを室温で10分間放置します。
2. 標準のカクテルを「C7」とラベル付けされたポリプロピレン製微量遠心チューブに移します。これがトップスタンダードとして使用されます。
3. 6本のポリプロピレン製微量遠心チューブにC6、C5、C4、C3、C2、C1のラベルを付けます。
4. これらの各チューブに75 μLのアッセイバッファーを添加します。
5. トップスタンダードのC7の25μLをC6チューブに移し、ボルテックスによりよく混合します。これがC6標準になります。
6. 各チューブの新しいピペットチップを使用して、次に低い標準チューブの75 μLのアッセイバッファーに前の標準試料の25 μLを加え、続いてボルテックスして標準物質C5、C4、C3、C2、およびC1を得ることにより、連続1:4希釈を続けます。アッセイバッファーを0 pg/mL標準試料(C0)として使用します。

4. サンプル希釈

>注:このアッセイを複数回希釈して使用する予備的なパイロット実験は、特定の生物学的サンプルセットに最も適切な希釈係数を決定するために必要になる場合があります。適切な希釈係数により、標準曲線の境界内にあるサンプルの濃度計算が生成されます。次の手順はガイドラインであり、サンプルの種類によっては経験的に決定する必要がある場合があります。

1. 血清または血漿サンプルをAssay Bufferで2倍に希釈します(例:50 μLのサンプルを50 μLのAssay Bufferで希釈します)ポリプロピレン製微量遠心チューブに入れます
   手記：さらにサンプルを希釈する必要がある場合は、正確な測定を確実にするために、アッセイバッファーの代わりにマトリックスBで希釈を行う必要があります。希釈せずに血清サンプルや血漿サンプルを添加すると、アッセイの精度が低下し、フィルタープレートが詰まる可能性があります。マトリックスBは、内在性アッセイ標的が枯渇したプールされたマウス血清で構成されています。イムノアッセイの分析感度に影響を与えることが知られているマトリックス効果を避けるために、血清または血漿サンプル希釈剤として使用されます。
2. 希釈せずに細胞培養上清サンプルを試験します.
   手記：分析物のレベルは、サンプルごとに大きく異なります。必要に応じて、上清サンプルを対応する細胞培養培地またはアッセイバッファーの新鮮な調製物を使用して希釈します。

5. アッセイ手順

>注:このアッセイは、ポリプロピレンフィルタープレート、マイクロ蛍光活性化セルソーティング(FACS)チューブ、またはVボトムマイクロプレートで行うことができます。フィルタープレートアッセイ手順は、サンプル間の一貫性、アッセイの堅牢性、および取り扱いの容易さから推奨されます。この手順には、洗浄用の真空ろ過ユニット(エンドユーザーが提供)が必要です。

1. すべての試薬を室温(20〜25°C)まで温めてから使用してください。
2. アッセイのセットアップおよびインキュベーションステップ中は、プレートの底部が漏れの原因となるため、プレートの底が表面に触れないように、常に逆さプレートカバーにフィルタープレートをセットしてください。
3. 洗浄ステップを含むアッセイ手順全体を通して、ビーズを失わないようにプレートを直立させてください。
4. プレートを暗所に保管するか、すべてのインキュベーションステップでアルミホイルで包
んでください。
5. すべての標準試料とサンプルを、プレート上に順番に並べた複製として分析します。
6. 各ウェルに100 μLの1x Wash Bufferを添加してフィルタープレートを事前に湿らせ、室温で1分間放置します(フィルター底部マイクロプレートを使用している場合)。
7. バキュームマニホールド(5〜10秒)を使用してバッファボリュームを取り外します。真空の10"Hgを超えないようにしてください。プレートの底から余分なウォッシュバッファーを拭き取り、清潔なペーパータオルの山にプレートを押し付けます。倒立プレートカバーの上にプレートを置きます.
   手記：ステップ5.1〜5.2は、アッセイがV底マイクロプレートまたはマイクロFACSチューブを使用して行われる場合、省略できます。
8. 細胞培養上清サンプルの場合は、すべてのウェルに25 μLのAssay Bufferを添加します。各標準液25μLを標準ウェルに加えます。各サンプルを25 μLをサンプルウェルに加えます。
9. 血清または血漿サンプルを測定するには、25 μL のマトリックス B を標準ウェルに加えます。25 μLのアッセイバッファーをサンプルウェルに加えます。各標準液25μLを標準ウェルに加えます。希釈した血清または血漿サンプルごとに25 μLをサンプルウェルに加えます。
10. 混合ビーズを30秒間ボルテックスし、各ウェルに25μLの混合ビーズを加え、ビーズボトルを断続的に振ってビーズが沈降しないようにします。ビーズの添加後、各ウェルの最終容量は75 μLである必要があります。
11. プレートシーラーでプレートを密封します。倒立プレートカバーを含むプレート全体をアルミホイルで包みます。プレートをプレートシェーカーに載せて固定し、室温で約500rpmで2時間振とうします。漏れを防ぐため、プレートシーラーに陽圧を加えないでください。
12. 反転せずに、プレートをバキュームマニホールドに置き、前と同じようにバキュームを適用し、各ウェルに200μLの1xウォッシュバッファーを加えます。
13. アッセイプレートウェルの内容物を真空ろ過により除去します。プレートの底から余分な洗浄バッファーを吸収性パッドまたはペーパータオルで拭き取ります。この手順をもう一度繰り返します。
    手記：アッセイがV底マイクロプレートまたはマイクロFACSチューブを使用して行われる場合は、ステップ1.12および1.13をスキップします。代わりに、プレートを室温で1,000 x gで5分間遠心分離し、マルチチャンネルピペットを使用して上清を除去します。
14. 各ウェルに25 μLの検出抗体(材料表を参照)を添加します。
15. 新しいプレートシーラーでプレートを密封します。倒立プレートカバーを含むプレート全体をアルミホイルで包みます。
16. プレートをプレートシェーカーに置き、室温で約500rpmで1時間振とうします。
17. 真空引きせずに、25 μLのストレプトアビジン-フィコエリトリン(SA-PE)試薬を各ウェルに直接加えます。試薬を希釈する必要はありません。
18. 新しいプレートシーラーでプレートを密封します。倒立プレートカバーを含むプレート全体をアルミホイルで包みます。
19. プレートをプレートシェーカーに置き、室温で約500rpmで30分間振とうします。
20. 上記の手順1.13を繰り返します。
21. 各ウェルに200 μLの1x Wash Bufferを添加します。プレートシェーカーにビーズを1分間再度懸濁します。
22. マルチチャンネルピペットを使用して、フィルタープレートからFACSチューブにサンプルを移し、フローサイトメーターでサンプルを読み取ります.
    手記：サンプル量を200 μLから300 μLに増やすには、各チューブに100 μLの1x Wash Bufferを追加することで、サンプルが枯渇するのを防ぐことができます。必要に応じて、サンプルを4°Cで保存し、光から保護し、翌日分析することができます。ただし、サンプルの保存が長引くと、シグナルが低下する可能性があります。