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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 腫瘍関連単球由来樹状細胞の単離
- 層流フードで、CO2安楽死マウスから腫瘍を採取し、ウシ胎児血清(FBS)を含まないRPMI培地に腫瘍を留置します
手記：腫瘍を切除する前にマウスを剃り、70%エタノールを噴霧することは、毛皮からの潜在的な汚染を最小限に抑えるために強く推奨されます。腫瘍が大きいほど樹状細胞(DC)が少なく、壊れやすく細胞死を起こしやすい傾向があるため、腫瘍が25〜40 mm2を超えないようにしてください。より多くのDCが必要な場合は、各マウスに複数の部位に腫瘍細胞を注入できます。
- 滅菌された層流フードの下で、手術用ハサミを使用して腫瘍を小片(約1 x 1 mm2)に切り刻みます。
- 1匹のマウスから採取したすべての腫瘍断片を、5 mLのハンク平衡塩溶液(HBSS)、2 mg/mLコラゲナーゼIV、および0.01 mg/mL DNase I.
を含むマグネティックスターバー付きの30 mL滅菌平底チューブに加えます
注意：骨髄系細胞は、定常状態でもグリコシル化によってエネルギーを生成します。したがって、グルコースを含む培地(HBSS、ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)、ダルベッコのモディファイドイーグルメディウム(DMEM)など)のみを使用してください。グルコース飢餓がわずか10〜15分続くと、24時間以内に細胞死とアポトーシスが起こります。コラゲナーゼはグラム陽性菌(Clostridium histolyticum)によって生成されるため、低エンドトキシンコラゲナーゼIVのみを使用してください。.
- マグネチックスターラーを備えた37°Cインキュベーターで約200〜400rpmで20〜30分間撹拌します。
- 5 mLの完全培地を加え、激しく再懸濁します。
- 70μmのセルストレーナーで細胞をろ過します。4°C400 rcfで5〜10分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
注意：一部の腫瘍は壊死性であり、比較的大量の細胞破片または細胞外マトリックスを含んでいるため、酵素消化の直後に細胞を分離しようとしないでください。15%密度グラジエント培地に細胞を塗布して、細胞のみを取得します。
- 9 mLの密度勾配培地を10倍リン酸緩衝生理食塩水(PBS)1 mLで懸濁して浸透圧を調整し、100%Percollストック溶液を得ます。1.5 mLの密度勾配培地ストック溶液を8.5 mLのHBSSと混合し、腫瘍由来の細胞ペレットと激しく混合します。15%密度グラジエント培地の上に2 mLのDMEMを穏やかに重ね、室温で400 rcfで20分間遠心分離します。細胞がチューブの底にペレットを形成するため、上清を捨てます。
- ペレット化した細胞を、2% FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、および 10 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含む 10 mL HBSS に再懸濁して 2 回洗浄し、4 °C 400 rcf で 5 〜 10 分間遠心分離して細胞をペレット化します。
- トレパンブルーを用いた血球計算盤の光学顕微鏡で細胞をカウントします。
- 1 × 108細胞を1 mLのアイソレーションバッファーに再懸濁し、30 μLのCD11b+標識磁気ビーズと4°Cで15分間インキュベートします。
注意:CD11c標識ビーズの使用は、DCを活性化し、細胞死を誘発するため、避けてください。FcγRIIおよびFcγRIIIを抗CD16/32抗体でブロックしようとしないでください。ブロッキング抗体はFcγRをライゲーションし、マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼの強力なリン酸化を誘導し、DCをプライミングします。
- 9 mLの単離バッファーを加えて余分な未結合ビーズを取り除き、細胞を400 rcfで4°Cで5〜10分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、細胞を1 mLのアイソレーションバッファーに再懸濁します。事前に洗浄した磁気カラムに細胞を塗布します。カラムを3 mLのアイソレーションバッファーで2回洗浄します。
- マグネットからカラムを取り外します。6 mLのアイソレーションバッファーをカラムにピペットで移し、プランジャーを押して磁気標識細胞を滅菌コレクションチューブに洗い流します。細胞を400 rcfで4°Cで5〜10分間遠心分離します。
- 細胞を1 x 107細胞あたり100 μLで再懸濁し、次の蛍光色素標識抗体で染色します:Linage陰性(TCRb、Siglec F、B220、CD19、FceRIおよびLy6G)、MHCII、Ly-6C。
- 側方散乱光(SSC)および前方散乱光(FSC)を使用して小細胞をゲーティングし、5 ng/mL GM-CSF を添加した完全培地で培養することにより、細胞を 37 °C で 1 時間インキュベートして、マクロファージがプレートに付着できるようにします。次に、遊離細胞と非接着性細胞を新しい培養皿に移します.
手記：マウスのMoDCは、CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/intと定義されています。Ly6Cの発現は腫瘍モデル間で大きく異なる可能性があり、一部のモデル(LMPなど)では、MoDCはLy6Cの発現を完全に欠いています。1つの100 mm3 B16F10腫瘍は、典型的には5 x 104のDCを含み、その結果、合計で約4〜5×106個の細胞が生じる。これらの細胞のうち、10 - 15%が免疫細胞で、8 - 10%がMoDC細胞です。DC数の増加は、マウスに複数の部位に腫瘍を注入することで達成できます。他の骨髄系細胞はCD11cやLy6Cなどのマーカーを発現できるため、小さなSSC/FCS細胞のみを選別します><。
随意：腫瘍浸潤性単球を、Ly6Chiを発現し、MHCIIが陰性の小さなSSC/FSC細胞として選別します。その後、単球をin vitroで50 ng/mL GM-CSFで培養し、DCを取得します。
2. 腫瘍-IgG免疫複合体の調製
- 腫瘍細胞を75 cm2培養フラスコで、完全DMEM培地中で70%コンフルエントまで培養します。
- 0.25% トリプシン/EDTA を 2 mL 添加して培養フラスコから細胞を分離し、光学顕微鏡で細胞の形態をモニターして、トリプシンの過剰化を防ぎます。
- トリプシン消化を阻害するために8mLの完全培養培地(トリプシン2mLあたり)を加え、4°C、400rcfで5〜10分間遠心分離して細胞をペレット化します
手記：市販のPCRキットを使用して、腫瘍細胞のマイコプラズマを確認します。Limulus Amebocyte Lysate (LAL) アッセイを使用して、グラム陰性菌および真菌エンドトキシンを検査します。血清は0.22μMでろ過し、連邦規則集9のウイルスについて試験する必要があります。さらに、100〜200μLをLB寒天またはブロスに滴下して培地と血清をテストし、37°Cで2日間培養します。
- トリプシンおよび血清からの細胞を再度洗浄し、10 mLのPBSでそれらを再懸濁し、5 - 10分間400 rcfで遠心分離し、上清を吸引し、洗浄を2回繰り返すことによって残る。
- 細胞を1.8%緩衝パラホルムアルデヒドに室温で10分間固定します。
- 細胞を10mLのPBSに再懸濁して洗浄し、4°C400rcfで5〜10分間遠心分離します。
- 上清を吸引し、さらに2回洗浄を繰り返します.
随意：腫瘍取り込みアッセイでは、1 μMカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)を含むPBSで細胞を37°Cで5分間インキュベートすることにより、細胞を標識できます。その後、CFSEを完全な培地で氷中で10分間急冷します。細胞は、残留色素を除去するために、2%血清を含むPBSで広範囲に洗浄する必要があります。
- 蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファー(PBSに2% FCS + 5 mM EDTAを添加)および0.5 μg/mLの抗CD16/32に細胞を再懸濁して、潜在的な非特異的タンパク質間相互作用をブロックします。U字型の96ウェル/プレートに、100μLあたり1×105セルの濃度でプレート化。
- 5 μg - 5 ng/1 x 105細胞の範囲の腫瘍結合抗体の異なる希釈液を添加します。プレートを氷上で15〜20分間インキュベートします
手記：IgG抗体は、記載されているように、ナイーブな20〜24週齢の雌マウスの血清からプロテインAカラムで単離されました。
- 150 μLのPBSを添加し、プレートを4°C400 rcfで5〜10分間遠心分離して細胞を洗浄します。
- 上澄みを捨てて、洗濯を2回繰り返します。フルオロフォア標識二次抗体を含む100 μL FACSバッファーに細胞を再懸濁します。プレートを氷上で20分間インキュベートします。
- 200 μLのFACSバッファーを添加し、プレートを400 rcfで5〜10分間遠心分離して細胞を洗浄します。
- フローサイトメトリーによる腫瘍結合の解析を行い、細胞のコーティングに必要な最小濃度を決定します。
手記：染色された腫瘍細胞の平均蛍光強度(MFI)がアイソタイプコントロールよりも少なくとも5倍増加しない抗体は、その後の機能アッセイで使用しないでください。
3. Tumor-IgG ICによるMoDCの活性化
- セクション2.1から2.4.3で説明されているように、腫瘍細胞を最小のIgG濃度でコーティングします
- 腫瘍ICでMoDCを活性化する1日前に、GM-CSFを含むMoDC培地を交換してください。これを行うには、培地を穏やかに吸引し、事前に温めた完全培養培地で細胞を一度洗浄します
手記：単離された成熟腫瘍関連MoDCは、GM-CSFを含まない完全培地で選別した後、ICで活性化する前に、少なくとも2〜3時間(または一晩)培養する必要があります。
- 腫瘍取り込み解析では、CFSE標識腫瘍ICをMoDCに1:5(IC:MoDC)の比率で添加し、1 x 106 DCあたり1 mLの完全培地で12〜16時間一晩インキュベートします。
- MoDC活性化実験のFACS解析では、腫瘍ICを1:1(IC:MoDC)の比率で添加し、12〜16時間
で一晩インキュベートします。
手記：MoDCを1 μg/mLのLPSまたは他のTLRアゴニストで刺激するポジティブコントロールウェルを含めることを強くお勧めします。
- 一晩活性化した後、上清を吸引し、アイソレーションバッファーまたは10 mM EDTA HBSS で細胞を 3 回穏やかに洗浄します。
- DCをプレートから分離するには、10 mM EDTAを含む1 mL HBSSで細胞を2〜3分間インキュベートし、激しいピペットで細胞を分離します。
- 細胞を400 rcfで遠心分離し、2% FCS、5 mM EDTA(FACSバッファー)、および0.5 μgのブロッキング抗体を添加した90 μL PBSに1 x 106 DCを再懸濁します。氷上で5〜10分間インキュベートします。
- 10 μLの染色用抗体混合物を細胞に加え、氷上で15分間インキュベートします。
- 2 mLのFACSバッファーを細胞に加え、4°C 400 rcfで5〜10分間遠心分離します。
- 細胞を200 μL FACSバッファーに再懸濁します。
- サンプルを泳動する1〜2分前に0.5〜1μg/mLのDAPIを添加し、死細胞を分析から除外します。DPIは、MoDCが10〜15分以内に取り上げるため、過度にインキュベートしないでください。