免疫組織化学による脳組織中の異常なプリオンタンパク質の検出

Abstract

出典:Orge, L., et al. Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (2023).

このビデオは、免疫組織化学を用いて脳切片の誤って折り畳まれたプリオンタンパク質を検出する技術を示しています。脳切片をギ酸で処理してプリオンを変性させ、感染リスクを最小限にとどめるとともに、熱誘起エピトープ賦活化を用いてプリオン凝集体のマスキングを解除した後、ミスフォールディングされたプリオンタンパク質凝集体を免疫標識し、顕微鏡で観察します。

Protocol

1. 組織切片作成とスライド調製

1. ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織の切片を3〜5 μmの厚さでミクロトームを使用して切断します。
2. 使用したパラフィンの融点より約10°C低い温度の精製水に切片を浮かせます。切片を水から持ち上げて、特別に処理された顕微鏡スライドに載せます(材料の表を参照)。スライドから水が完全に排出されるようにします。
3. スライドを50°Cで一晩インキュベートして、組織のスライド接着を強化します.
   手記：IHCプロトコルでは、新たに切片化された組織を調製することが望ましいですが、TSEのポジティブおよびネガティブコントロール切片は事前に調製して保存することができます。ステップ2から4は、化学ドラフトで実行する必要があります。

2. 脱パラフィンと再水和

1. スライドを組織切片と一緒にステンレス製の染色バスケットに入れます(材料の表を参照)。バスケットをキシレンバス(ステンレス製の染色容器)に3分間浸し、取り出して再度浸します。
2. キシレンを除去し、切片を無水エタノール浴に3分間浸して再水和します。
3. 切片を風乾し、90%エタノール浴に1分間入れ、さらに70%エタノール浴に移し、続いて50%エタノール浴に1分間移します。エタノール浴処理ごとに、スライドバスケットを2回静かに攪拌し、次の移し替えの前にバスケットを排水します。.

3. エピトープ検索

1. 室温で98%ギ酸に組織切片を30分間慎重に浸し、切片を水道水で5分間すすぎ、続いて蒸留水で2回すすぎます
   注意：ギ酸は腐食性が高いです。保護メガネと手袋の着用が義務付けられています。
2. 以下の手順に従って、熱誘起抗原賦活化(HIER)を実行します
   手記：このステップは、特定の圧力チャンバー内で121°Cで30分間水和オートクレーブすることによって行われます(「材料の表」を参照)。
   1. クエン酸緩衝液(10 mM、pH 6.1、材料表を参照)を、500 mLの蒸留水で満たされた圧力チャンバー内に置いたステンレス製染色容器で98°Cで約20分間予熱します
      手記：本研究では、使用した特定の機器について、プログラムの設定値は1(SP1)であった。
   2. アラームが機器がプログラムされた時間と温度に達したことを示したら、バスケットをスライドで浸し、プログラムをセットポイント2(121°Cで30分間)に開始します。品質管理の目的で、粘着性オートクレーブインジケーターテープの一部をバスケットに置き、温度と圧力を監視し、このプログラムの初期圧力と最終圧力を記録します。
   3. 免疫染色するスライドの数がバスケットの容量に達しない場合は、清潔なブランクスライドを使用して空いている位置を占有します。プログラムが終了したら、チャンバーを周囲圧力に受動的に戻す(少なくとも30分)
      手記：持続時間が長いほど、非特異的なバックグラウンド染色が減少する可能性があります。
   4. スライドバスケットを蒸留水で満たされたステンレス製の染色容器に5分間慎重に移します。

4. 内因性ペルオキシダーゼの不活性化

1. サンプル切片を含むスライドバスケットをメタノール中の3%過酸化水素(H₂O₂)の浴に30分間浸し、切片を流水ですすいでください(5分間)。切片を水気を切り、1x Tris緩衝生理食塩水(TBS)にさらに5分間浸します。

>5. 免疫検出

>注:本研究では、市販のスライドクリップアセンブリシステムを使用して、キャピラリーギャップ形式を使用して免疫検出を実行しました(材料の表を参照)。他の免疫組織化学スライドシステムも適用可能です。

1. 各スライドを、TBSであらかじめ湿らせた市販のカバープレートホルダー(材料の表を参照)に置き、気泡を避け、ティッシュ側をホルダーに向け、スライドの端をホルダーの2つの下部ポイントに合わせます。
   1. スライドホルダーアセンブリを親指と人差し指で持ち、片方の指をサンプルスライドの上に置き、もう片方の指をホルダーの下部に置きます。次に、アセンブリをシステムのギャラリーに配置します。
   2. セットがしっかりと組み立てられていることを確認するために、サンプルスライドとホルダーの間のウェルにTBSを充填します。この時点から、ホルダーとスライドの間に約80μLのTBSを保持する必要があります。セクションを乾燥させないでください。
2. システム内に入れたら、一次抗体(プリオンタンパク質に対する抗体(抗PrP))で処理する前にバックグラウンド染色を減らすために、免疫染色に使用されている二次抗体宿主(この場合はウマ血清)と同じ種由来の20%正常血清とサンプルスライドをTBSで30分間プレインキュベー
トします。
3. 分析対象の動物種に応じて使用する抗体のアリコート数、検査するサンプル切片の数、および作業希釈液の量を解凍します。
   手記：最良の結果を得るには、二次抗体および一次抗体溶液の供給源として、同じ動物種由来の10%正常血清を使用してください。可能であれば、最良の結果を得るためには、正常な血清と二次抗体の宿主源は同じ動物種由来のものでなければなりません。
4. 切片を洗浄せずに、スライドホルダーセットの各ウェルに直接(200 μL)一次抗体溶液を塗布し、室温で60分間インキュベー
トします。
5. 洗浄は、スライドホルダーセットのウェルにTBSを充填し、5分間待ってから2回繰り返します。
6. ビオチン化二次抗体(モノクローナル抗マウスHorse Ab、材料表参照)をTBSで1/200に希釈し、10%ウマ血清を用いてください。処理するセクションの数に応じて必要なボリュームを準備します。
7. 二次抗体溶液(200 μL)をスライドホルダーセットの各ウェルに塗布します。室温で30分間インキュベートします。
8. 手順5.5の説明に従って洗浄します。
9. アビジン-ビオチン複合体ペルオキシダーゼ(ABC/HRP複合体、材料表を参照)とのインキュベーションでは、使用の30分前に試薬を調製してください。ABC/HRP複合溶液(200 μL)をスライドプレートホルダーセットの各ウェルに塗布します。室温で30分間インキュベートします。
10. 手順5.5の説明に従って洗浄します。

>6. 3,3'ジアミノベンジジン(DAB)色素剤による開発

>注意:DABは発がん性物質の可能性があります。そのため、この試薬を使用する際には、目の保護具、白衣、手袋、適切な検査手順など、適切なケアが必要です。地域の規制に従って廃棄してください。

1. 使用直前に、製造元の指示に従って発色剤を希釈してください(材料の表を参照)。.発色剤溶液(400 μL)をスライドプレートセットの各ウェルに塗布します。
2. 室温で最大30分間インキュベートします。PrP^Sc(プリオンタンパク質の異常アイソフォーム)陽性切片では、通常10分のインキュベーション期間で十分です。
3. スライドを蒸留水で洗浄することにより、残留発色剤溶液を除去します。スライドをカバープレートホルダーから取り外し、蒸留水を入れたプラスチック容器に入れます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
無水エタノール	ラボケム	LB0507-9010	原液
			蒸留水で90%、70%、50%を希釈
アビジン-ビオチン複合体とペルオキシダーゼ ベクタステインエリートABCキットペルオキシダーゼ	ベクターラボラトリーズ	PK-6100	キットの指示に従って、使用の30分前に準備し、静かに混合します。立ったまま混ぜないでください。
ビオチン化二次抗体(ウマ抗マウスIgG H+L)	ベクターラボラトリーズ	BA-2000-1.5	TBSで1/200に希釈し、10%ウマの正常血清で希釈します。セクション数に応じて必要なボリュームを準備します。
クロモゲンジアミノベンジジン-DAB、基質キット、ペルオキシダーゼ	ベクターラボラトリーズ	SK-4100	キットの指示に従って使用前に準備してください. 切片あたり400μLの溶液を使用してください。
DakoCytomation Pascal圧力チャンバー	だこ	S2800
エールリッヒのヘマトキシリン:
無水エタノール	ラボケム	LB0507-9010
氷酢酸	メルク	101830
カリウムミョウバン	メルク	1.01047.1000
グリセリン	メルク	1.04091.1000
内因性ペルオキシダーゼブロック溶液(3%濃度H2O2):			40 mL 過酸化水素 (30% w/w) を 360 mL メタノールに溶か 使用前に準備する
過酸化水素(30%w / w)	シャーラウ	HI0136
メタノール	シグマ・アルドリッチ	322415から2L
ギ酸 98%	メルク	1.00264.1000	原液
ミクロトーム	シャンドン-AS325	ミクロトーム	シャンドン-AS325
TBS中の正常血清(20%)ブロック溶液: 馬の正常な血清	ギブコ	16050-122	アッセイのセクション数に応じて最終容量を調製します (セクションあたり200μLの溶液)。
一次抗体 抗PrPマウス MAb 2G11	バイオラッド	MCA2460	PrP 146-R154R171182 非定型のスクレイピー、子宮頸管、ネコ科の動物を含むヒツジ。bovine. には適していません アッセイのセクション数(セクションあたり200 μLの溶液)と抗体の希釈率に応じて、二次抗体が産生された種(ウマの正常血清)から正常血清の10%を添加したTBSで最終容量を準備します 通常の抗体希釈:MAb 2G11 1/100ですが、新しいバッチごとに作業希釈を確立する必要があります。保存するには、最低10 μLのアリコート容量を滅菌マイクロチューブに凍結します。解凍して、一度に1つのアリコートを使用します。
一次抗体 抗PrP マウス MAb 12F10	ケイマンケミカルカンパニー	189710	PrP142-160 ウシ、ovine には適していません 通常の抗体希釈:1/200ですが、作業希釈も設定する必要があります。MAb 2G11として調製
シャンドンカバープレートTMチャンバー	サーモサイエンティフィック	72110017
シャンドン・セクエンツァ®・インミュニシング・センター	サーモサイエンティフィック	73300001
Shandon Sequenza® Immunstainingスライドラック	サーモサイエンティフィック	73310017
溶液クエン酸バッファー(10 mM pH 6.1):			2.55 gのクエン酸三ナトリウム二水和物と0.255 gのクエン酸1リットルの精製水 10 mMクエン酸溶液(500 mL精製水に1.05 gのクエン酸) を使用して、作業溶液のpHを6.1に調整します アッセイ当日に調製します。
三クエン酸ナトリウム二水和物	シグマアルドリッチ	S4641-500G
クエン酸	シグマ・アルドリッチ	C0759
染色ジャーとバスケット	デルタラブ	19360
		19361
Superfrost Plus 顕微鏡スライド	VWRの	〒631-0108
トリス緩衝生理食塩水(TBS)(50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS(原液0.5 M TRIZMA塩基、8%NaCI、pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 gおよびNaCl 80 gを800 mL精製水に入れます。塩酸37%を使用して原液のpHを調整し、精製水で最終容量を1リットルに調整します(5±3°Cを2か月まで保持します) アッセイ日にTBS原液を1/10に希釈します。
トリズマベース	シグマ・アルドリッチ	T6066-1KG
塩化ナトリウム(NaCl)	メルク	106404
キシレン	Panreac Applied Chem ITW試薬	251769	原液