免疫組織化学による脳組織中の異常なプリオンタンパク質の検出

Abstract

出典:Orge, L., et al. Detection of Abnormal Prion Protein by Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (2023).

このビデオは、免疫組織化学を用いて脳切片の誤って折り畳まれたプリオンタンパク質を検出する技術を示しています。脳切片をギ酸で処理してプリオンを変性させ、感染リスクを最小限にとどめるとともに、熱誘起エピトープ賦活化を用いてプリオン凝集体のマスキングを解除した後、ミスフォールディングされたプリオンタンパク質凝集体を免疫標識し、顕微鏡で観察します。

Protocol

1. 組織切片作成とスライド調製

1. ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織の切片を3〜5 μmの厚さでミクロトームを使用して切断します。
2. 使用したパラフィンの融点より約10°C低い温度の精製水に切片を浮かせます。切片を水から持ち上げて、特別に処理された顕微鏡スライドに載せます(材料の表を参照)。スライドから水が完全に排出されるようにします。
3. スライドを50°Cで一晩インキュベートして、組織のスライド接着を強化します.
   手記：IHCプロトコルでは、新たに切片化された組織を調製することが望ましいですが、TSEのポジティブおよびネガティブコントロール切片は事前に調製して保存することができます。ステップ2から4は、化学ドラフトで実行する必要があります。

2. 脱パラフィンと再水和

1. スライドを組織切片と一緒にステンレス製の染色バスケットに入れます(材料の表を参照)。バスケットをキシレンバス(ステンレス製の染色容器)に3分間浸し、取り出して再度浸します。
2. キシレンを除去し、切片を無水エタノール浴に3分間浸して再水和します。
3. 切片を風乾し、90%エタノール浴に1分間....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
無水エタノール	ラボケム	LB0507-9010	原液
			蒸留水で90%、70%、50%を希釈
アビジン-ビオチン複合体とペルオキシダーゼ ベクタステインエリートABCキットペルオキシダーゼ	ベクターラボラトリーズ	PK-6100	キットの指示に従って、使用の30分前に準備し、静かに混合します。立ったまま混ぜないでください。
ビオチン化二次抗体(ウマ抗マウスIgG H+L)	ベクターラボラトリーズ	BA-2000-1.5	TBSで1/200に希釈し、10%ウマの正常血清で希釈します。セクション数に応じて必要なボリュームを準備します。
クロモゲンジアミノベンジジン-DAB、基質キット、ペルオキシダーゼ	ベクターラボラトリーズ	SK-4100	キットの指示に従って使用前に準備してください. 切片あたり400μLの溶液を使用してください。
DakoCytomation Pascal圧力チャンバー	だこ	S2800
エールリッヒのヘマトキシリン:
無水エタノール	ラボケム	LB0507-9010
氷酢酸	メルク	101830
カリウムミョウバン	メルク	1.01047.1000
グリセリン	メルク	1.04091.1000
内因性ペルオキシダーゼブロック溶液(3%濃度H2O2):			40 mL 過酸化水素 (30% w/w) を 360 mL メタノールに溶か 使用前に準備する
過酸化水素(30%w / w)	シャーラウ	HI0136
メタノール	シグマ・アルドリッチ	322415から2L
ギ酸 98%	メルク	1.00264.1000	原液
ミクロトーム	シャンドン-AS325	ミクロトーム	シャンドン-AS325
TBS中の正常血清(20%)ブロック溶液: 馬の正常な血清	ギブコ	16050-122	アッセイのセクション数に応じて最終容量を調製します (セクションあたり200μLの溶液)。
一次抗体 抗PrPマウス MAb 2G11	バイオラッド	MCA2460	PrP 146-R154R171182 非定型のスクレイピー、子宮頸管、ネコ科の動物を含むヒツジ。bovine. には適していません アッセイのセクション数(セクションあたり200 μLの溶液)と抗体の希釈率に応じて、二次抗体が産生された種(ウマの正常血清)から正常血清の10%を添加したTBSで最終容量を準備します 通常の抗体希釈:MAb 2G11 1/100ですが、新しいバッチごとに作業希釈を確立する必要があります。保存するには、最低10 μLのアリコート容量を滅菌マイクロチューブに凍結します。解凍して、一度に1つのアリコートを使用します。
一次抗体 抗PrP マウス MAb 12F10	ケイマンケミカルカンパニー	189710	PrP142-160 ウシ、ovine には適していません 通常の抗体希釈:1/200ですが、作業希釈も設定する必要があります。MAb 2G11として調製
シャンドンカバープレートTMチャンバー	サーモサイエンティフィック	72110017
シャンドン・セクエンツァ®・インミュニシング・センター	サーモサイエンティフィック	73300001
Shandon Sequenza® Immunstainingスライドラック	サーモサイエンティフィック	73310017
溶液クエン酸バッファー(10 mM pH 6.1):			2.55 gのクエン酸三ナトリウム二水和物と0.255 gのクエン酸1リットルの精製水 10 mMクエン酸溶液(500 mL精製水に1.05 gのクエン酸) を使用して、作業溶液のpHを6.1に調整します アッセイ当日に調製します。
三クエン酸ナトリウム二水和物	シグマアルドリッチ	S4641-500G
クエン酸	シグマ・アルドリッチ	C0759
染色ジャーとバスケット	デルタラブ	19360
		19361
Superfrost Plus 顕微鏡スライド	VWRの	〒631-0108
トリス緩衝生理食塩水(TBS)(50 mM TRIZMA BASE; 0.8% NaCI; pH 7.6):			10xTBS(原液0.5 M TRIZMA塩基、8%NaCI、pH 7.6): TRIZMA BASE 60,57 gおよびNaCl 80 gを800 mL精製水に入れます。塩酸37%を使用して原液のpHを調整し、精製水で最終容量を1リットルに調整します(5±3°Cを2か月まで保持します) アッセイ日にTBS原液を1/10に希釈します。
トリズマベース	シグマ・アルドリッチ	T6066-1KG
塩化ナトリウム(NaCl)	メルク	106404
キシレン	Panreac Applied Chem ITW試薬	251769	原液