1. 免疫原の調製
- 表1に記載の条件下で、対応する培地で各シアノバクテリア株を増殖させる
注:各シアノバクテリア株の増殖培地および培養条件を表1に示します。K17を除くすべてのシアノバクテリア株は、自治大学(スペイン、マドリード)のアントニオ・ケサダのグループに属しています。Planktothrix rubescensに対する抗体は、Vilasouto貯水池(スペイン北部)からのこのシアノバクテリアの単一特異的ブルームの天然サンプルから生成されました。
- 光学顕微鏡によるセルカウンティングチャンバーを使用して細胞数を定量し、後期指数関数的または定常的な増殖期の培養から約108細胞/mLを取得します。
- 5 mLの培養物から細胞を2,000 x gで5分間遠心分離して
回収します。
- 上清を捨て、5 mLの1x リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)を入れた10 mLチューブに細胞を再懸濁して、約108細胞/mLを得ます。
- 携帯型のハンドヘルド超音波プロセッサを使用するか、またはチューブを最大振幅(30kHz)で細胞撹乱物質の水浴に浸すことにより、氷上で30〜60秒の休止を挟みながら、それぞれ30秒の超音波処理により、懸濁液の細胞を均質化および溶解する。
- シアノバクテリアの各菌株について、手順1.3〜1.5を繰り返します。
注:超音波処理は細胞破壊と細胞内容物の放出を引き起こします。タンパク質や多糖類は優れた免疫原ですが、脂質や核酸などの特定の分子は、それ自体では体液性免疫原性応答を誘導しません。したがって、それらは多糖類やタンパク質などの担体に結合して、分子の複雑さを増す必要があります。さらに、超音波処理は、抗体産生を誘発することができる細胞内物質を放出する。
2. ポリクローナル抗体の作製
- ステップ1.5で得られた0.5mLの超音波処理細胞溶解物を0.5mLの完全フロイントアジュバントと混合することにより、最初の免疫原用量を調製します。ポリクローナルウサギ抗体作製のための動物施設の運営者にお届けします。
- ステップ1.5で得られたのと同じホモジネート/ライセート0.5 mLを0.5 mLの不完全なフロイントアジュバントと混合することにより、抗体産生プロセスでのメモリブーストとしてさらに使用するために、前回と同様にさらに3回分調製します。抗体産生プロセスを完了するために、それらを動物施設に与えてください。
- 新しい抗体産生プロセスごとに、ステップ2.1と2.2を繰り返します。
注:通常、抗体産生は、動物を扱うためには適切なライセンスとトレーニングが必要なため、専門の動物施設や企業に委託されます。両社は、血清サンプル中に存在する抗原特異的抗体の量の相対的酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)測定を提供しています。
3. 抗体精製
- ステップ2で採取した免疫血清と免疫前血清の両方から免疫グロブリンG(IgG)画分をプロテインAアフィニティークロマトグラフィーで精製します。カートリッジシステムに基づく一部の市販の精製キットは、うまく機能します。プロバイダーの指示に従います。
- 精製キットに脱塩システムがない場合は、精製した抗体の溶出後に、透析または膜孔径が100 kDa(またはそれ以下)の遠心フィルターデバイスを使用して、バッファーを0.1x PBSに交換してください。
- 280 nmでの吸光度を測定するか、Bradford、Lowry、またはBicinchoninic acid(BCA)などの比色法を使用して、抗体濃度を測定します><。
注:アミン基(Trisバッファーなど)は、エポキシ基で活性化された固体表面への結合で抗体と競合するため、溶出バッファーにアミン基を含めないようにすることが重要です。精製後、ELISAで抗体活性をテストすることが重要です。
4. 蛍光抗体の標識
- セクション3で得られた精製抗体を蛍光色素(近赤外蛍光色素など)で標識するには、1 mgのタンパク質を100 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に100 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)に標識するための市販のバイアルを溶解します。溶解した色素2 μLを、最終容量50 μLの50 μLの50 mMリン酸緩衝生理食塩水(pH 8.5)で、各抗体調製物に2 mg/mLの濃度で加えます。
- ラベリング反応を、振動プラットフォーム上で周囲温度および1,200rpmで1時間連続的に攪拌しながら維持します。
- サイズ排除クロマトグラフィー(例えば、1.5〜30 kDaの分画範囲を持つゲルをカラムにトラップする)により、サプライヤーの推奨に従って標識抗体を精製します。
- 溶出液中の 280 nm と 650 nm の吸光度を測定し、サプライヤーの推奨に従ってラベリング効率を計算します。
注:1 mgのタンパク質を標識するための蛍光色素の1つのバイアルで最大50 x 50 μLの抗体標識反応を行うことができます。チューブをアルミホイルで覆うか、ステップ4.3後の急冷プロセスを避けるために、不透明な0.5mLチューブを使用することをお勧めします。IgG抗体の場合、抗体1molあたり3-7molの色素で最適な標識が達成されます。
5. CYANOCHIPの生産
- プリンティング溶液中の抗体とコントロール
- 各精製抗体を印刷溶液中で調製し、市販の1xタンパク質プリンティングバッファーに各抗体を1 mg/mLで混合し、0.01% (v/v) Tween 20(非イオン性界面活性剤)を最終濃度として調製します。
注:あるいは、抗体溶液は、炭酸塩緩衝液(pH 8.5)中に20%グリセロール、1%(w / v)スクロース(または防腐剤としてのトレハロース)、および0.01%(v / v)Tween 20を含有してもよい。
- コントロールとして、(a)0.01%(v/v)Tween 20を含む1xタンパク質プリンティングバッファー、(b)0.01%(v/v)Tween 20を含む1xタンパク質プリンティングバッファーに1 mg/mLのタンパク質A精製免疫前血清、および(c)0.01%(v/v)Tween 20を含む1xタンパク質プリンティングバッファーに1 mg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)をコントロールとして調製します。
- ステップ5.1.1のように、1xタンパク質プリンティングバッファーに異なる濃度(例えば、50 μg/mLから1 μg/mL)の蛍光標識精製免疫前血清30 μLを調製します。これらのサンプルは、蛍光フレームマーカーとして、またスポッティング後の相対蛍光定量に使用されます。
- ステップ 5.1.1、5.1.2、および 5.1.3 で調製したプリンティング溶液のウェルあたり 30 μL を、ポリプロピレンなどのマイクロアレイ製造用の最高品質の 384 ウェルマイクロプレートに加えます
注:タンパク質プリンティングバッファーは抗体の品質と安定性を向上させ、Tween 20はスポットの形態を均質化し、タンパク質のカップリングを構築します。384ウェルマイクロプレートは、使用前に4°Cに維持することをお勧めします。-20°Cで長期間保管してください。ポリプロピレンは、DNA、タンパク質、細胞抽出物、および低分子の固有結合が少ないです。
- 顕微鏡スライドへの抗体印刷
注:抗体を活性化した顕微鏡スライドに印刷するには、接触式、スプリットニードル、または圧電プリンターや「インクジェット」技術などの非接触型デバイスなど、さまざまなアレイプラットフォームを使用します。この研究では、CYANOCHIPは、μmスケールでnL量の抗体を検出できるロボットシステム(アレイアー)を使用して、接触によって定期的に印刷されています。
- 印刷室の環境条件を20°C、相対湿度40〜50%に設定します。
- スライド基板(例:75 x 25 mmエポキシ活性化顕微鏡スライド)をセットアップして、各スライド上に複数の同一の抗体アレイを実行します。
- 精製された各抗体(コントロールおよび参照フレームを含む)を3重のスポットパターンでスポットし、これらの条件下では、スポットの直径は180〜200μmである。
- 印刷後、スライドを周囲温度で少なくとも30分間放置して乾燥させ、4°Cで保存します。現場での作業のために、スライドは数ヶ月間周囲温度で輸送および保存することができます。
注:CYANOCHIPは、スライドごとに3 x 8の同一マイクロアレイ、または1 x 9マイクロアレイ形式で9つの同一アレイを備えたトリプリケートスポットマイクロアレイ形式で印刷されます。各アレイサイズは、24ウェルガスケットの反応チャンバー寸法(通常、3 x 8ハイブリダイゼーションチャンバーでは7.5 x 6.5 mm)より大きくてはなりません。
- マイクロアレイを使用して環境サンプルを分析する前に、蛍光サンドイッチマイクロアレイイムノアッセイ(FSMI)を使用して、滴定曲線の各抗体の作業希釈率を決定します。各抗体について、対応する免疫原の標準濃度(103 - 104細胞/mL)と蛍光抗体の段階希釈(1:500〜1:32,000)を使用します。最適な抗体濃度は、滴定曲線で得られた最大シグナル強度の50%に相当します。また、各抗体の感度と特異性は、Blancoらに記載されているように決定する必要があります。
>6. 蛍光サンドイッチマイクロアレイ免疫測定法(FSMI)のための環境多検体抽出物の調製
- 液体サンプルからの多検体抽出物
- 滅菌シリンジ(例えば、貯水池の岸からの水)で液体サンプルの1〜100mLを採取します;サンプルの量は、ターゲットの潜在的な濃度に大きく依存します。
- 水サンプルを孔径3μm、直径47mmのポリカーボネートフィルターに通して細胞を濃縮します。陽性検出には103 - 108細胞/mLの細胞濃度が望ましいですが、実際の濃度は不明です。
- 改質トリス緩衝生理食塩水、Tween 20強化緩衝液(TBSTRR;0.4 M Tris-HCl(pH 8)、0.3 M NaCl、および0.1% Tween 20)を15 mLチューブにスパチュラで掻き取り、1 mLの改変トリス緩衝生理食塩水(Tween 20)1 mLでフィルターに回収します。
- ステップ1.5で説明したように、ハンドヘルド超音波プロセッサを使用して、または単に複数回ピペッティングして、均質化および脱凝集し、これにより、マイクロアレイによる分析のためにサンプルが調製されます。
- 固体サンプルからの多検体抽出物
- 10 mLチューブに固体サンプル(岩石、土壌、堆積物など)を最大0.5 gの重量を量り、最大2 mLのTBSTRRを加えます。
- ソニケータープローブをチューブに浸すか、チューブを強力なソニケーターホーンの水浴に浸すか、ハンドヘルドソニケーターを使用して超音波処理します。30 kHz で少なくとも 5 x 30 秒のサイクルを実行し、氷上で 30 秒間停止します。
- 直径10〜12mm、孔径5〜20μmのナイロンフィルターホルダーに組み合わせた10mLシリンジで砂、粘土、その他の粗い物質を除去するフィルター。サンプルをフィルターを通して1.5 mLチューブに押し込みます。フィルターが飽和した場合は、シリンジ内の懸濁液を攪拌し、新しいものに移します。これにより、イムノアッセイ(ステップ7)用の濾液材料が調製されます。
注:TBSTRRのバッファリング容量は、サンプルの種類によって異なります。環境抽出物の調製直後にイムノアッセイを実施して、分析物に対する酵素分解の影響を回避することが重要です。あるいは、プロテアーゼ阻害剤を環境抽出物に添加し、次のステップまで-80°Cで凍結します。
>7. 蛍光サンドイッチマイクロアレイ免疫測定法 (FSMI)
- CYANOCHIPのブロッキング<br />
注:使用直前に、印刷したスライドを処理して、スライド上のすべての遊離エポキシ基をブロックし、共有結合していない抗体を過剰に除去します。
- マイクロアレイを5%(w/v)BSA溶液を含む0.5 M Tris-HCl(pH 9)に5%(w/v)BSA溶液で浸漬し、ロッカープラットフォームから穏やかに攪拌しながら、ロッカープラットフォームから5分間温和に攪拌します。または、上記の溶液の100〜200μLの滴下にスライドを置き、マイクロアレイスポットをそれに向けてください。3〜5分間放置してから続行します。
- 先端がプラスチック製の鉗子を使用してスライドを慎重に持ち上げ、マイクロアレイゾーンに触れないようにしてください。スライドをペーパータオルにそっとたたくして、余分な液体を取り除きます。ロッカープラットフォームから穏やかに攪拌しながら、2%(w/v)BSA溶液を含む0.5 M Tris-HCl(pH 8)に30分間浸
漬します。
- 顕微鏡スライドに適合した市販の微量遠心分離機を使用して、短時間の遠心分離(200〜300 x gで1分間)を行い、スライドを乾燥させます。または、ペーパータオルにそっとたたくしてスライドを乾かします。
- マイクロアレイによる多検体サンプル抽出物のインキュベーション
- スライドを市販のマイクロアレイハイブリダイゼーションカセットにセットアップし、複数のマイクロアレイ用に24ウェルで行います。プロバイダーの指示に従ってください。
- スライドとカセットを組み立てた後、サンプル抽出物を最大50 μLまでピペットで、またはTBSTRRで希釈してカセットの各ウェルにピペットで入れます。
- 分析するサンプルごとに手順7.2.2を繰り返します。
- ブランクコントロールとして、50 μLのTBSTRRバッファーをカセットの少なくとも2つの別々のウェルにピペットで移します。
- 周囲温度で1時間インキュベートし、15分ごとにピペッティングするか、軽く振とうして混合します。あるいは、4°C.
で12時間インキュベートします。
注:他のインキュベーションガスケットは、マイクロアレイパターンの機能として使用してください。ステップ7.2.5のインキュベーションの時間と温度は、通常、各抗原抗体のペアの親和性と結合速度に依存する経験的パラメータです。
- 洗浄
- サンプルを取り出しますampカセットを下ろし、清潔で吸収性の強い紙の上に慎重にたたきます。
- ウェルをそれぞれに150 μLのTBSTRRを加えて洗浄し、上記のようにバッファーを除去します。
- 手順7.3.2をさらに3回繰り返します。
- 蛍光検出器抗体によるインキュベーション
- 17種類の抗シアノバクテリア株抗体を含む抗体混合物50 μLを添加し、各抗体をTBSTRR中の蛍光色素で1%(w/v)BSAで標識します。混合物中の各蛍光抗体の濃度(0.7〜2 μg/mL)を、各抗原/抗体ペアの滴定実験により決定します。
- ステップ7.2.5に記載されているように、周囲温度で1時間、または4°Cで12時間インキュベー
トします。
- 蛍光抗体の洗い流し
- ステップ7.3のように、蛍光非結合抗体を除去します。
- カセットを分解し、スライドを0.1x PBS(50 mLチューブなど)に浸してすばやくすすぎます。
- ステップ7.1.3のようにスライドを乾かします。
8. 蛍光のスキャン
- スキャナーで近赤外蛍光色素の最大発光蛍光ピークでスライドの蛍光をスキャンして蛍光を検出します。マイクロアレイの画像を異なるスキャンパラメータで数枚撮影しますが、通常はレーザーゲイン値を下げます.
手記：飽和スポット(蛍光カウント>65,000)は、スケールから外れており、定量エラーを引き起こす可能性があります。
>表1. シアノチップの製造に使用した抗体(abs)とシアノバクテリア株のリスト。
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| ABコード | 免疫原(株) | 命令 | 生息地 | 中程度 | 文化条件 |
| K1 | アナバエナsp. | ノストカレス | 不明 | BG11と硝酸塩 | 30 ºC、連続光 |
| K2 | アナバエナsp. | ノストカレス | 不明 | BG11オ | 30 ºC、連続光 |
| K3 | ミクロシスティス ・フロサクアエ | クロオコッカレス | 浮遊 | BG11 | 28 º C、連続光 |
| K4 | ミクロシスティス・ノヴァセキイ | クロオコッカレス | 浮遊 | BG11 | 28 º C、連続光 |
| K5 | ミクロシスティス・エルギノサ | クロオコッカレス | 浮遊 | BG11 | 28 º C、連続光 |
| K6 | アファニゾメノン・オバリスポラム | ノストカレス | 浮遊 | BG11オ | 28 º C、連続光 |
| K7 | ホルミジウム属 | オシラシエータレス | 底生生物 | BG11 | 18ºC、16-8日長 |
| K8(ケイエイ | リブラリア属 | ノストカレス | 底生生物 | チュード | 18ºC、16-8日長 |
| K9 | Chamaesiphon sp. | クロオコッカレス | 底生生物 | BG11 | 18ºC、16-8日長 |
| K10(日本 | レプトリンビャボリヤナ | オシラシエータレス | 底生生物 | BG11 | 18ºC、16-8日長 |
| K11(日本 | Tolypothrix distorta | ノストカレス | 底生生物 | BG11オ | 18ºC、16-8日長 |
| K12(日本 | アファニゾメノン・アファニゾメノイデス | ノストカレス | 浮遊 | BG11オ | 28 º C、連続光 |
| K13(日本 | Nostoc sp. (南極大陸) | ノストカレス | 底生生物 | BG11オ | 13ºC、16-8日長 |
| K14 | アナバエナsp. | ノストカレス | 底生生物 | BG11オ | 13ºC、16-8日長 |
| K15(日本 | Leptolyngbya sp. | オシラシエータレス | 底生生物 | BG11 | 13ºC、16-8日長 |
| K16(日本未 | トリポスリクス属 | ノストカレス | 底生生物 | BG11 | 13ºC、16-8日長 |
| K17 | Planktothrix rubescens | オシラシエータレス | 浮遊 | 何一つ | 何一つ |