1. 3Dエラスチン様タンパク質(ELP)ハイドロゲルにおける細胞カプセル化
- シリコーン型の準備
- 希望の直径の生検パンチを使用して、厚さ0.5mmのシリコンシートに穴を開け、各穴の周りに正方形を切り取ります。必要な金型の数だけ繰り返します.
注:金型の直径と厚さは、特定のアプリケーションや細胞培養条件に合わせて調整できます。実際には、50 x 106細胞/mLの細胞培養では、十分なDNA/RNAおよびタンパク質抽出のために、それぞれ直径4 mmおよび5 mmの厚さ0.5 mmの型が推奨されます。免疫染色では、2 mmの生検パンチを使用して、正方形の型ごとに3つの隣接する穴を作成し、ウェルごとに3回の繰り返しを染色できます。
- 個々の型の両側にあるプラスチックラップをピンセットで取り外します.
手記：露出したシリコーン表面との接触は、汚染が将来のプラズマボンディング効率を低下させる可能性があるため、避けてください。
- ピンセットを使用して、48ウェルプレートの逆蓋に、裸のシリコンモールドとガラスカバースリップ(No.1、直径12mm)を交互に並べます。完了したら、汚染を避けるために48ウェルプレートの蓋を覆います。
- 酸素プラズマは、48ウェルプレートの蓋全体(つまり、金型とスライドガラス)を処理します。直後に、鉗子を使用して、シリコンモールドを隣接するガラスカバースリップに反転させます。金型をしっかりと押して接着します。型を室温で1時間インキュベートします
手記：酸素プラズマ処理の期間は、使用する機器によって異なります。当社の装置の典型的な条件は、0.3〜4 mbarの動作ガス圧力ウィンドウ、20 cm3 / minの酸素ガス流、および10〜20秒間のサンプルプラズマへの曝露です。
- オートクレーブで金型を滅菌します。金型は、使用するまで室温で無菌環境に保管してください.
手記：金型は、この段階で無期限に保管できます。
- エラスチン様タンパク質ストック溶液の調製
- 凍結乾燥ELPを4°Cの貯蔵から取り出します。チューブを開く前にタンパク質を室温まで温め、繰り返し使用してもタンパク質に結露が生じないようにします。
- ELPをダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に4°Cで溶解し、一晩中一定の攪拌(すなわち、紡糸)します
手記：ELPストック溶液の濃度は、ユーザーが定義した容量比で架橋剤溶液を添加することでさらに希釈されます。例えば、最終ELP濃度が3%(w/v)の場合、ELP溶液:架橋剤溶液の体積比が4:1になるように希釈する3.75%(w/v)ELPストック溶液を調製します。必要に応じて、目的のアプリケーションに合わせて濃度を調整します。
- 0.22 μmシリンジフィルターを使用した滅菌フィルターELPストック溶液。ELPを使用しないときは氷の上に置いてください。
- バイオセーフティキャビネットで、滅菌ピンセットを使用して滅菌型を24ウェル組織培養プレートに移します。
- テトラキス(ヒドロキシメチル)ホスホニウムクロリド(THPC)原液の調製
- 使用直前にTHPCをDPBSで希釈してください。最終的なELP濃度と目的の架橋比に応じてTHPC溶液の濃度を調整します.
手記：プロトコルでは、ELPストック溶液とTHPC溶液を4:1の体積比で混合することにより、最終ELP濃度3%(w / v)が得られます。必要に応じて調整します。
- 2.6 μL の THPC 溶液 (80% 水溶液) を 997.4 μL の DPBS.
に加えます。
手記：このTHPCの濃度は、最終的な3%(w / v)ELPヒドロゲルについて記載された4:1の体積比で溶液を混合すると、THPC上のヒドロキシメチル基とELPタンパク質上の第一級アミンの1:1の化学量論比に対応します。THPC溶液は粘性があり、溶液の液滴がピペットチップの側面に付着することがあります。正確な濃度を得るために、DPBSに希釈する際にはこのような液滴を避けてください。THPCストック容器を窒素ガスでパージし、ホスフィンの酸化と架橋剤の不活性化を防ぎます。
- 溶液をボルテックスして混合し、氷の上に保ちます。
- 0.22 μmシリンジフィルターを使用してTHPCストック溶液を滅菌ろ過します。THPCストック溶液を滅菌DPBSでさらに希釈して、化学量論的架橋比(0.5:1または0.75:1など)を低くします。.
手記：THPCは酸素に敏感であり、希釈溶液は調製後数時間以内に使用する必要があります。
- トリプシン-EDTAとインキュベートして細胞を単一細胞懸濁液に解離し、細胞をペレット化し、血球計算盤を使用して培地に再懸濁した細胞をカウントします
手記： このステップの正確なプロトコールは、目的の細胞タイプとアプリケーションに大きく依存します。このプロトコル全体で使用される神経前駆細胞について、0.025%トリプシン-EDTAインキュベーションを室温で1.5分間行った。細胞を200 x gで2分間ペレット化した。細胞生存率を高めるには、細胞を通常の培地条件で懸濁する必要があります。細胞カプセル化に使用される一般的な細胞密度は、1 - 50 x 106細胞/mLの最終ヒドロゲル容量の範囲です。必要に応じて調整します。
- 必要な数の細胞を滅菌済みの1.5 mL遠心分離チューブに分注します。
- 細胞を~200 x gで3分間遠心分離し、慎重に上清を吸引し、細胞ペレットを氷上に保ちます
手記： ELPおよびTHPC架橋剤のさらなる希釈を軽減するために、すべての上清を完全に吸引することが重要です。特定の遠心分離速度は、細胞の種類によって異なります。
- 細胞ペレットをELPストック溶液に再懸濁し、容量が最終容量の80%になるようにします(ELP溶液:THPC溶液の比率が4:1と仮定します)。ピペットで20〜25回混合して、細胞とELP.
の均質な混合物を生成します。
手記： ELPの温度上昇とそれに続く相転移を軽減するために、チューブの底をつかまないでください。3回の繰り返しを持つ各2 mmモールドには、7.5 μLの最終容量(つまり、6 μLのELPストック溶液と1.5 μLのTHPCストック溶液)が3つの穴に均等に分割される必要があります(つまり、穴ごとに2.5 μLの最終容量)。4 mmと5 mmの金型には、それぞれ7.5 μLと15.5 μLの最終容量が必要です。
- THPCストック溶液をセル/ELP懸濁液に加え、残りの20%の最終容量にします。ピペットで20〜25回混合して、均質な混合物を生成します。
- すぐに、対応する最終量のセル/ ELP / THPC混合物を円運動で各金型にピペットで移します。すべての金型に対して繰り返します。
- サンプルを室温で15分間インキュベートし、続いて37°Cで15分間さらにインキュベートします
手記：最初のインキュベーション期間は、ELPの下限臨界溶液温度(LCST)を超える温度まで温度を上昇させ、その熱相偏析を誘発する前に、ハイドロゲルの初期架橋を促進するのに役立ちます。
- 24ウェルプレートの各ウェルに750 μLの温細胞培養培地をゆっくりと加え、ゲルの破壊を避けます。
- ハイドロゲルを37°Cで7日間インキュベートします.
手記：細胞の種類に応じて、1〜2日ごとに培地を完全に交換することをお勧めします。ゲルへのストレスを抑えるために、ウェルから培地を吸引する際には、200 μLのピペットチップを取り付けたガラス製のパスツールピペットを使用してください。
2. 3D ELPハイドロゲルにおける細胞の免疫細胞化学
- 10 mL 16%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)を30 mL DPBSに混合して、固定液を調製します。溶液を37°Cに温めます。
- 24ウェルプレートから培地を吸引し、1 mLのDPBSで穏やかに洗浄します。
- 各ウェルに750 μLの固定溶液を加え、37°Cで30分間インキュベートします。PFA蒸気による他の培養物の汚染を避けるために、組織培養インキュベーターを使用しないでください。
- 各ウェルから固定溶液を慎重に吸引し、PFAを適切な有害廃棄物容器に廃棄します
注意：PFAにさらされると、皮膚や眼に炎症を引き起こす可能性があります。手袋/安全メガネを着用し、化学薬品のヒュームフードで作業してください。
- 各サンプルに1 mLのDPBSを加えます。DPBSはすぐに吸引し、PFA廃棄物容器に廃棄します。
- サンプルを1 mLのDPBSで2回、それぞれ10分間洗浄します
手記：サンプルは、Parafilmでプレートをシールした後、最大1週間、4°CのDPBSに保存できます。
- 各サンプルを750 μLの透過処理溶液(100 mLのDPBSおよび0.25 mLのTriton X-100;PBST)を15rpmのロッカーで室温で1時間
。
- PBSTを吸引し、750 μLのブロッキング溶液(PBS95 mL、ウシ血清アルブミン(BSA)5 g、血清5 mL、Triton X-100 0.5 mL)を各サンプルに加えます。室温でロッカー上で15 rpmで3時間インキュベートします.
手記： ブロッキング溶液には、二次抗体が産生された宿主種(ヤギ、ロバなど)の血清が含まれ、使用前に0.22 μmフィルターで滅菌ろ過する必要があります。
- 抗体希釈液(DPBS97 mL、BSA2.5 g、血清2.5 mL(EPLを調製する宿主種と同じ種由来)、およびTriton X-100 0.5 mL)を調製します。抗体希釈液を使用して一次抗体を希釈し、各サンプルに500 μLの溶液を加えます。プレートをパラフィルムで密封し、ロッカーで4°Cで一晩インキュベートします
手記： NestinおよびSox2一次抗体は、メーカーの元の濃度から抗体希釈液で1:400に希釈しました。
- 各サンプルから抗体溶液を吸引し、PBSTでサンプルを室温で15rpmのロッカーで60分間洗浄します。洗浄手順を3回繰り返します。
- 抗体希釈液を使用して二次抗体と5 mg/mLストックDAPI(1:2,000)を希釈し、各サンプルに500 μLの溶液を加えます。24ウェルプレートをアルミホイルで覆い、ロッカーで4°Cで一晩インキュベートします
手記：二次抗体は光感受性であるため、その後のすべてのステップでサンプルを光退色から保護する必要があります。ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギ二次抗体は、抗体希釈溶液でメーカーの元の濃度から1:500に希釈しました。
- 各サンプルから抗体溶液を吸引し、ロッカーでPBSTで30分間室温でサンプルを洗浄します。洗浄手順を3回繰り返します。
- ハードセット封入剤をスライドガラスの表面に一滴垂らします。鉗子を使用して、ペーパータオルで型の端を軽く吸い取り、余分な溶液を型から取り除きます。金型を逆さまにして封入剤の上に慎重に置き、気泡が発生しないようにします。
- 封入剤を室温で48時間硬化させます。サンプルは室温または4°Cで保存し、硬化の過程で培地の屈折率が変化するため、イメージングする前に封入剤を48時間完全に硬化させます。透明なマニキュアでサンプルをスライドガラスカバーに密封し、汚染やサンプルの移動を軽減します。
- 共焦点顕微鏡を使用してサンプルを画像化します。
