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1. 抗体ペプチドの標識
>注:NLS(ChAcNLS)に結合したコール酸は、任意の商用ペプチドメーカーまたは大学関連のペプチド合成サービスプラットフォームで合成できます。
- 1.7 mLの微量遠心チューブに、pH 7.6のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解した7G3の10 mg/mL(~1 mg総抗体)溶液を調製します。
- スルホスクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート(スルホ-SMCC)をジメチルスルホキシド(DMSO)に5〜10 mMの濃度で溶解します。溶液を徹底的にボルテックスすると、完全に溶解するために最も効果的です。
- 7G3を含むチューブに溶解した硫黄-SMCC溶液(通常は5〜20μL)を添加します(必要なスルホ-SMCCと-7G3のモル比に応じて)。sulfo-SMCC と 7G3 の比率を 10 対、25 対、50 対 1 でテストすることをお勧めします。室温で1時間インキュベートします。
- マレイミド誘導体化7G3を限外ろ過装置とPBS、pH 7.0でのバッファー交換を使用して精製および濃縮します。8,000 x gで約5分間遠心分離します。フロースルーを廃棄し、PBS、pH 7.0で充填し、再度遠心分離します。
- これを7〜8回実行して、バッファを完全に交換します。濃縮された7G3タンパク質を回収するには、フィルターデバイスを逆さまにして清潔な微量遠心チューブに入れます。1,000 x gで2分間遠心分離します。回収量は約0.3mLである必要があります。
- マレイミド活性化7G3を含むチューブに、前のステップで使用したスルホ-SMCC-to-7G3比と比較して2倍モル過剰のChAcNLSを添加し、4°Cで一晩インキュベートします。たとえば、10:1 の sulfo-SMCC 対 7G3 比を使用した場合、20:1 の ChAcNLS 対 7G3 比を使用します。総体積は大きく変更しないでください。
手記：ChAcNLSは標識プロセス中に沈殿を引き起こしませんが、これは他のペプチドでも起こり得ることです。反応中にチューブを観察して、沈殿の兆候がないか確認しますが、これはペプチドが疎水性である場合に引き起こされる可能性が最も高いです。このような場合、親水性を高めるための設計変更を行うために、目的のペプチドを再検討する価値があるかもしれません。
- 限外ろ過装置を使用して、7G3-ChAcNLSを所望の濃度まで濃縮し、PBS pH 7.4でバッファー交換します(ステップ1.4を参照)。総タンパク質の回収収率は、元の出発物質の75%≥である必要があります。
- 12% ポリアクリルアミドゲルを使用して構築された 7G3-ChAcNLS 候補を評価するために、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) を実施します (非共役鎖から ChAcNLS 共役重鎖と軽鎖を十分に分離します)。2 μLのβ-メルカプトエタノールを含むPAGEローディングバッファーに10 μgの7G3-ChAcNLSを混合し、ウェルにロードします。
- 適切な電圧(12%ゲルの場合は1時間で120V)を設定し、電気泳動を実行します。Coomassie色素の前面がゲルの底に達したら、電気泳動を停止します。
手記：クマシー染料の前面がゲルから流れ出さないようにしてください。
- 電気泳動装置からゲルを取り出し、10% v/v の氷酢酸と 20% v/v のメタノールを含む脱染液ですすいでください。
- ゲルの写真を撮り、定規を使用して、標準試料と7G3コンジュゲートについて移動した距離(cm)を測定します。保持係数(Rf)値(これは、移動距離をゲル長で割った値(タンパク質がロードされる場所からクーマシー移動フロントまで)です)を計算します。分子量(MW)をlogでプロットし、各タンパク質標準試料のRf値に対してプロットし、7G3コンジュゲートのサイズを外挿します。
- 7G3コンジュゲートと未修飾7G3のMW差を1768.5 g/mol(ChAcNLSのMW)で割って、抗体あたりのペプチド数を計算します。
- クマシー染色ゲルのデジタル画像を撮影し、デンシトメトリー分析を行います。この時点で、リード候補の選択は、重要な凝集分子を含まないChAcNLS分子の最大数を持つACに基づいて行うことができます。
2. 共焦点顕微鏡による細胞内蓄積評価
>注:目的のペイロードを持つ製剤を開発する前に、ペプチド修飾モノクローナル抗体の細胞内蓄積の細胞選択性をテストすることが重要です。Tatは非特異的な細胞浸透の傾向があることも示されているため、高価なペイロードでコストのかかる開発ステップを行う前に、まず細胞内蓄積と細胞選択性を分析する価値があります。このため、手順1では、アイソタイプ特異的で無関係なコントロールmAbも変更する必要があります。残りのプロトコルでは、抗体ごとに 10 個の ChAcNLS 分子で修飾された AC を使用します。手順 2 と 3 の主要な手順を含む概略図を図 1 に示します。
>注意:プロトコルのこのステップには、パラホルムアルデヒドの取り扱いと操作が含まれます。取り扱いの際は、メーカーの指示に従ってください。
- 標的TF-1a細胞を、修飾コントロールmAbを含む200 nMの7G3-ChAcNLSで処理します。5 x 106抗原陽性細胞をコンジュゲートと共に37°Cで1時間インキュベー
トします。
- 1時間後、上清を取り除き、氷冷したPBSで1mLを3回洗浄します。新鮮な培地を加え、37°Cでさらに1時間インキュベートします。
- さらに1時間後、上清を取り除き、氷冷したPBS1mLで3回洗浄します。0.25%トリプシンとエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含むPBS0.5 mLを37°Cで3〜30分間3〜30分間加えます><。
手記：初期のパイロットテストでは、AC細胞内蓄積の違いを判断するために、細胞をトリプシン化しないことが推奨されます。このプロトコルはトリプシンの使用を促進し、これによりさまざまなAC候補の細胞内蓄積効率の評価がどのように改善されるかを示します。
- インキュベーションのさまざまな時間を、剥離しているすべての細胞を視覚的に確認してテストします。さらに、細胞アリコートを生存率染色溶液でインキュベートし、前述のようにフローサイトメトリー解析を行います。
- 1.5 mLの細胞培養RPMI 1640培地/10%ウシ胎児血清でトリプシンを中和します。細胞を500 x gで5分間遠心分離し、上清を除去し、0.5 mLの氷冷PBSで3回洗浄します。
- 1%パラホルムアルデヒドと1%スクロースを含む0.5 mL PBSに細胞を氷上で30分間固定します。氷冷PBSで細胞を3回洗浄し、250 x gで5分間遠心分離します。0.15% Triton X-100を含む0.5 mL PBSで細胞を氷上で5分間透過処理します。氷冷PBSで細胞を洗浄し、遠心分離を繰り返します。
- AlexaFluor 647に結合した抗マウス(アイソタイプ特異的)Fc二次ポリクローナル抗体を2 μg/mL(またはメーカー推奨濃度)含有する0.1 mL PBSに細胞を室温、暗所で1時間懸濁します。
- 250 x gで5分間遠心分離し、0.5 mLの氷冷PBSで細胞を3回洗浄します。細胞を0.5 mL PBS.
に懸濁します。
休止：細胞は冷蔵庫に保存できます.
手記：目的のモノクローナル抗体の正しいアイソタイプを認識する二次抗体を選択することが不可欠です。AF647は、遠赤外線を放射するため、原子核のヨウ化プロピジウム(PI)染色を妨げないために選択されています。
- PIを10 μg/mLの濃度で細胞の入った容器に加えます。次に、1 x 105セルを封入剤を使用してスライドガラスにマウントし、ガラスカバースリップで覆います。
- Plan Apo 60X 油浸対物レンズ NA 1.42 を倒立レーザー走査型共焦点顕微鏡で細胞を検査します。488 nmのアルゴンレーザーと600 - 650 nmのスペクトル走査プリズムセットを使用してPI蛍光を検出します。AF647蛍光には、633 nmのヘリウムネオンレーザーと650〜700 nmに設定されたスペクトルスキャンプリズムを使用します。PIおよびAF647からの蛍光発光を順次収集します.
手記：セルの評価と比較全体で同じ設定を使用します。ただし、トリプシン処理されていない細胞と比較して、トリプシン処理された細胞の設定を調整する必要があります。
- 顕微鏡ソフトウェアを使用して画像を取得します。1,024 x 1,024 ピクセルのシリアル水平光学セクションを使用して、セルの厚さ全体にわたって 0.5 μm 間隔で 2X ライン平均法で画像を収集します。画像を、最大蛍光強度で 4 つの連続したスライスからの積み重ねられた z 投影として表示します。
- 顕微鏡ソフトウェアで細胞を解析します。コンジュゲートの細胞分布パターンを記録します。具体的には、細胞質内の細胞内蛍光がグループ化され、細胞表面近くにあるか、びまん性で均一であるかを評価します。また、細胞あたりの相対蛍光強度も評価します。
