Aβペプチド特異的抗体とAβオリゴマーのラット海馬への制御注入

要約

出典:Sajadi, A., et al. Neurodegeneration in an Animal Model of Chronic Amyloid-β Oligomer Infusion Is Counteracted by Antibody Treatment Infused with Osmotic Pumps. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、アミロイドベータ(Aβ)ペプチド特異的抗体をラットの海馬に連続注入する技術を示しています。この研究では、Aβペプチド特異的抗体の制御された注入と可溶性Aβオリゴマー(Aβo)のラット海馬への注入を組み合わせて、オリゴマーと抗体との間の相互作用を研究するための両側カニューレシステムを埋め込むことを採用しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脳定位固定術前のカテーテル準備

1. カニューレを浸透圧ポンプに接続するために使用するPE50カテーテル(長さ6cm)をカットします(図1を参照)。PE50カテーテルに人工脳脊髄液(aCSF)を充填し、カテーテルの両端を密封します。使用するまでカテーテルを4°Cに保ちます。

2. 定位固定法によるカニューレ移植

1. 無菌状態で手術を行います。すべての手術器具と材料をオートクレーブ滅菌します。脳定位固定装置と作業領域を徹底的に清掃し、70%エタノール溶液で消毒します。サージカルマスク、ヘアボンネット、滅菌手袋を着用してください。
2. ケタミンとキシラジンの溶液(それぞれ100 mg / kgと10 mg / kg)を腹腔内(i.p.)に注射してラットに麻酔をかけます。.つま先を優しくつまんだ後の動きを確認して麻酔を確認します。
3. 非ステロイド性抗炎症薬(メロキシカム; 1 mg / kg)を、手術の少なくとも30分前に麻酔をかけた動物に皮下(s.c.)に注射します。.
4. バリカンを使用して動物の頭を剃り、グルコン酸クロルヘキシジン2%とイソプロピルアルコール2%の溶液で皮膚を3回消毒します。麻酔下での乾燥を防ぐために、獣医用眼科用軟膏を目に塗ります。.
5. 動物を耳のバーのある定位固定装置フレームに置きます。1つのカニューレを脳定位固定装置フレームのホルダーアームに固定します。局所麻酔薬(ブピバカイン(1.5 mg / kg)とリドカイン(1.5 mg / kg)を頭のてっぺんに注射します(皮下)。麻酔は、3%イソフルランを送達するノーズコーンを配置することにより、全手順中に維持されます。手術野全体を覆う必要がありますが、ここでは技術をよりよく示すために行われませんでした。
6. メスで頭のてっぺんに3cmの切開をします。切開部の周りに4つのクランプを取り付けて、頭蓋骨を空けておきます。丸い先端のはさみを使用して、動物の肩甲骨の間の皮膚の下にポケット(2 x 2 cm²)を作ります。
7. 頭蓋骨の骨膜を刃でこすります。出血している場合は、頭蓋骨にガーゼパッドを貼ります。
8. 頭蓋骨が平らで、脳定位固定装置フレームにしっかりと位置合わせされていることを確認します。頭蓋骨が平らであることを確認するには、ブレグマとラムダの高さ座標を確認します。参照点として使用される bregma 座標を取ります。
9. ブレグマから始めて、海馬に両側に移植される 2 つのガイドカニューレの座標を計算します (前後: -0.42 cm; 中外側: ± 0.30 cm; 背腹側: -0.28 cm, Paxinos と Watson ラットの脳アトラスによる)。カニューレの位置をマーカーで示します。
10. 両方のカニューレの移植点で頭蓋骨に穴(0.5 mm)を開けます。これらのポイントの上下約5mmに他の2つの穴を開けて、歯科用セメントを塗布するときにカニューレを固めるネジを挿入します。
11. 以前にaCSFを充填したカテーテルの一端をメスで切断し、カニューレのアングルアームに挿入します。最初のカニューレを歯科用セメントで固定します。2番目のカニューレの位置の周りに歯科用セメントを置かないでください。
12. デンタルセメントを2〜3分間乾燥させてから、ホルダーアームを最初のカニューレから取り外し、2番目のカニューレをその中に固定します。手順 2.11 と 2.12 を繰り返します。両方のガイドカニューレにダミーのカニューレを取り付けます。ダミーとガイドカニューレの長さが同じであることを確認して、組織の浸潤とカニューレの閉塞を防ぎます。
13. 両方のカテーテルの自由端を、動物の肩甲骨の間に事前に作られたポケットに挿入します。クランプを取り外し、縫合糸4-0.
    で皮膚を縫います 手記： トップガイドカニューレは、今後のAβo注入のためにアクセス可能でなければなりません。
14. 動物を脳定位固定装置フレームから取り外し、ケージに戻します。術後の回復中は、動物が目を覚ますまでケージを加熱水ブランケットの上に置きます。ケージは、必要に応じてラットが熱から逃れることができるように、パッドに部分的に配置する必要があります。動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を常に監視します。
15. ラットを動物施設に戻し、手術から回復するために10日間、綿密な監視の下で.
    手記：手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻さないでください。メロキシカム(1 mg / kg)は、痛みを治療するために手術後2日間、1日1回投与されます。.

3. 浸透圧ポンプの設置

1. 設置の1日前に、浸透圧ポンプに6E10抗体(1 mg/ml、100 μl)を充填し、滅菌条件下で製造元の指示に従ってIgG1抗体(1 mg/ml、100 μl)をコントロールします。ポンプを37°Cの滅菌蒸留水に一晩置いて、ポンプを作動させます。
2. ラットにイソフルラン3%を麻酔して浸透圧ポンプ(0.5μl/hr、7日間)を設置します。肩甲骨の間を剃り、グルコン酸クロルヘキシジン2%とイソプロピルアルコール2%の溶液で皮膚を消毒します。肩甲骨の間にメスで2cm切開し、ガイドカニューレに接続されたPE50カテーテルを見つけます。
3. 歯科用セメントを含むPE50カテーテルの端をメスで切断します。浸透圧ポンプをPE50カテーテルに接続し、ポンプとカテーテルの接合部に歯科用セメントを追加して接続を固定します。
4. 縫合糸4-0で皮膚をしっかりと縫います。動物をケージの加熱ウォーターパッドに戻します。動物がイソフルラン麻酔から急速に目覚めるのを観察します(約5分).
   手記： 手術には約5〜10分かかります。

4. 覚醒して自由に動くラットへのアβo注入

1. アビーゾ溶液(0.2 μg/μl)を調製します。Βoを室温で1時間動的かつ自発的に凝集させてから注入します。
2. 輸液ポンプに10μLシリンジ2本を取り付けます。シリンジに5 μlの滅菌蒸留水を入れます。PE50カテーテル2本をメスで長さ約60cmに切ります。1 mLの注射器と21Gの針を使用して、両方のカテーテルに滅菌蒸留水を入れます。
3. 1 mlシリンジをカテーテルの一方の端に保持し、もう一方の端をハミルトンシリンジに接続します。.1mlのシリンジを取り外し、カテーテル内に気泡がないことを確認します。
4. PE50カテーテルの端に内部カニューレを挿入します。滅菌蒸留水を使用して、PE50カテーテルに接続された内部カニューレをハミルトンシリンジで最大1μlまで充填します。ピストンを最大2μlまで引き戻して気泡を作ります。
5. Aβo溶液を、付着力が最小限になるようにピペッティングして上下に混合します。混合中に気泡を形成しないようにしてください。ピストンを3.5 μlまで引き戻して、両方の内部カニューレに1.5 μlのAβo溶液を充填します。
6. 両方のカテーテルの気泡の前後にマーカーで線を描きます。これは、継続的な注入のチェックポイントとして機能します。輸液の場合は、ケージを輸液ポンプの近くに持ってきて、カバーを外します。
7. ネズミを寄り添い、寄り添いの腕を首にしっかりとこすりつけて、ネズミの頭を固定します。2つのガイドカニューレからダミーカニューレを取り外します。ガイドカニューレにあらかじめ用意した内部カニューレを挿入します。それらが完全に挿入され、ガイドカニューレの基部にしっかりと固定されていることを確認します。
8. ネズミを寄りかかった状態から解放し、ケージに戻して、争いのストレスを制限します。カテーテルがねじれないように注意深く監視し、注入が正しく行われるようにします。
9. 輸液ポンプの電源を入れます。1 μlのAβo溶液を0.1 μl/分の速度で(10分間)注入します。注入中は、シリンジ ピストンが 3.5 μl から 2.5 μl に移動し、両方の PE50 カテーテルの気泡が連続して移動することを確認します。
10. 注入後さらに5分間、内部カニューレをそのままにして、Aβo溶液を効率的に拡散させます。ラットを寄りかかって戻し、内部カニューレとキャップ付きガイドカニューレを取り外して、注入された溶液の逆流を防ぎます。カニューレのアングルアームの直前で停止するダミーカニューレを使用します。動物をケージに戻します。
11. アビーオの注入を1日1回、6日間連続して繰り返します。斬首によって動物を安楽死させます。

結果

図 1.Aβo注入中の両側カニューレを持つ動物の写真。Aβo溶液(0.2 μg/μl;1 μl)を、ガイドカニューレに挿入した内部カニューレに接続されたPE50カテーテルを使用して、覚醒状態および自由に動くラット(1日1回、6日間)に注入しました。コントロール(Ctl)IgG1または6E10抗体による治療は、動物の肩甲骨の間に皮下に配置された浸透圧ポンプを使用して、Aβo注入部位に直接注入されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
人工脳脊髄液(aCSF)	ハーバード大学装置	〒59-7316
PE50カテーテル薄壁	プラスチック1	C232CT
ケタミン塩酸塩(100mg / mL)	バイオニッチ	1989529
キシラキシン塩酸塩(100 mg / mL)	ビメダ	8XYL004C
メロキシカム(5 mg / mL)	ノーブルック	215670I01
グルコン酸クロルヘキシジン2%およびイソプロピルアルコール2%の溶液	ケアフュージョン	260100C
リドカイン塩酸塩	アルヴェーダ・ファーマ	0122AG01
ブピバカイン塩酸塩	ホスピーラ	1559
眼科用軟膏	バウシュ・アンド・ロム株式会社	2125706
脳定位固定装置用フレーム	ストールティング	51600
脳定位カニューレホルダーアーム	ハーバード大学装置	〒72-4837
ドリル	ドレメル	8050-N/18
ガイドカニューレ	プラスチック1	326OPG/SPC
インジェクションカニューレ	プラスチック1	C315I/SPC
ダミーカニューレ	プラスチック1	C315DC/SPC
縫合糸コーティングビクリルラピデ4-0	エチコン	VR2297
歯科用アクリルセメント	ハーバード大学装置	〒72-6906
ネジ	JIモリスカンパニー	P0090CE125
6E10抗体 (マウスIgG1アイソタイプ)	バイオレジェンド	803003
マウスIgG1アイソタイプコントロール抗体	アブカム	AB18447
Alzet浸透圧ポンプモデル1007D	デュレクトコーポレーション	290
イソフルラン	バクスター	CA2L9100
アミロイドベータ1-42	rペプチド	A-1163-1
ハミルトンシリンジ(10μL)	フィッシャー・サイエンティーク	14815279
輸液シリンジポンプ CMA 402	ハーバード大学装置	CMA8003110
シリンジ 1 mL	BDの	309659
ニードル 21G	テルモ	NN-2125R
寄り添う	ロミール・バイオメディカル	RTS04

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