静電容量式免疫プローブバイオセンサーを用いた標的ペプチドの検出と測定

要約

出典:Kluge, N. et al., Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart.J. Vis. Exp.(2022年)。

このビデオでは、静電容量式免疫プローブバイオセンサーを使用してペプチド伝達物質を検出および定量する方法を実演しています。抗体でコーティングされた官能基化された電極は、目的のペプチドと相互作用し、シグナルの変化を引き起こし、ペプチドの正確な測定と検出を可能にします。

プロトコル

1. 静電容量式免疫プローブの作製と機能化

1. パーフルオロアルコキシ(PFA)被覆白金線(材料表参照)を長さ25cmで切断し、白金線に食い込まないように注意しながら、メスで一端から約5mmのPFA被覆を剥がします。
2. 被覆を剥がしたプラチナ線の端を金メッキの 1 mm オスコネクタピンに挿入し、ラジオペンチを使用して被覆を剥がしたプラチナ線の端にコネクタピンの歯を圧着します(材料の表を参照)。
3. プラチナ線を金メッキコネクタピンにはんだ付けします。はんだの使用量が多すぎないように注意してください。
ドー
4. パミン溶液を攪拌して、50 mLの10 mMリン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 6.0)に50 mLを溶解してドーパミン溶液を調製します。
5. ドーパミンが完全に溶解したら、作りたてのドーパミンを補給したPBSの入った容器にプラチナワイヤーの先端を入れます。金色のコネクタピンをヘッドステージのチャネルに差し込みます(資料の表を参照)。
6. 塩化銀(AgCl)ディスク電極(接地電極、材料表を参照)をヘッドステージの接地チャネルに接続します。ドーパミンを補給したPBSとプラチナワイヤーが入った容器にAgClディスクを入れます。ディスク電極のみを沈め、ワイヤーやはんだの長さには注意しないでください。続行する前に、ヘッドステージのリファレンスチャネルにワイヤシャントを接続します。
7. 対話式データ集録ソフトウェアを開きます(資料の表を参照)。次のパラメータを使用して、のこぎり波電着コマンド電位プロトコルを準備します:開始電位= −0.6 V;最終電位 = +0.65 V;スキャンレート = 0.04 V・^s-1;堆積期間= 420秒。ポリドーパミン沈着プロトコルを開始し、すべてのワイヤが適切に接続されていることを確認します。
8. ポリドーパミンの沈着が完了したら、白金線電極の先端を乱さないように注意しながら、AgClの粉砕ペレットと白金線の先端を容器から取り出します。抗体溶液を調製しながら、ワイヤーの先端をPBS(pH 7.4)を含むマイクロチューブに2〜5分間入れます。ワイヤーの先端がマイクロチューブの側面または底面に接触していないことを確認します。
   注:抗体溶液は、ポリドーパミン沈着中に作ることができます。ただし、ポリドーパミン沈着後のドーパミン含有容器からPBSのマイクロチューブへの白金線の移動をスキップしないでください。.
9. 抗体溶液を調製します。目的の抗体をPBS(pH 7.4)と適切なサイズの容器(マイクロチューブなど)で1:20の比率で組み合わせます。
   注:ここで使用した抗神経ペプチドY(抗NPY)モノクローナル抗体(材料の表を参照)は、1 mg / mLで分注しました。ここでの抗体調製の例としては、76 μLのPBSに対して4 μLの抗体があります。
10. 白金電極のポリドーパミン堆積チップを抗体溶液に室温で最低2時間浸し、再びプラチナワイヤーの先端が溶液中に懸濁し、マイクロチューブの内面に留まらないようにします
    注:この技術の最近の実装では、後で使用するために湿式または乾式の保管の代わりに、このステップの直後に白金線電極を使用することが好まれています。
11. 抗体溶液に浸した後、新たに機能化した静電容量式免疫プローブ(CIプローブ)チップをPBS(pH 7.4)で短時間すすいでください。これで、プローブを使用する準備が整いました。

2. ペプチドのin vitro検出・測定のための実験装置

1. CIプローブの機能先端をフローチャンバーにセットし、電極の先端を乱さないように注意してください。プローブの感覚先端を損傷する恐れがあります
   注:フローチャンバーは、シリコンエラストマー(材料の表を参照)を35 mmの培養皿に注ぎ、皿の中央に細長い卵形のスペースフィラーを注入することによって作成されました。硬化後、エラストマーから卵形が取り除かれます。次に、チャンバーをトリス緩衝生理食塩水(TBS)でスーパーフュージョンし、流速を3 mL/分にします。流入と流出がチャンバー内の流体レベルを維持し、過灌流の潮汐作用が観察されないようにします。CIプローブが使用されている限り、フローは所定の位置に留まる必要があります。
2. 最初の実験テストの前に、TBS標準ランを実行してCIプローブをコンディショニングします。次のコマンド電圧プロトコルを設定します:正のステップ電位= + 100 mV;負のステップ電位 = −5mV;ステップ持続時間 = 20 ミリ秒。取得期間 = 600 秒
   注:データ取得前のサイクリングコマンド電位の初期段階でプローブの平衡化を考慮することが重要です。
3. 同じTBSを使用して目的のペプチドの溶液を作成し、スーパーフュージゼートの組成を維持します。チューブシステムやフローチャンバーに気泡を導入せずに、超灌流液をTBSとペプチド添加TBSの間で切り替えることができるマニホールドシステムを設定します。
   注:合成ブタNPYペプチド(材料の表を参照)を本研究では使用しました。
4. TBS標準パラメータを使用して、ペプチドセンシングデータ取得プロトコルをセットアップします(ステップ2.2を参照)。
   注:この実施では、各実験試験の持続時間は360秒(120秒TBS、120秒ペプチド添加TBS、120秒TBS)であった。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AgClディスク電極	ワーナー・インストゥルメンツ(マサチューセッツ州ホリストン)	〒64-1307
抗NPYモノクローナル抗体	アブカム(マサチューセッツ州ケンブリッジ)	ab112473
カスタムマルチチャンネルアンプ/ 1MΩフィードバック抵抗マルチチャンネルヘッドステージ	NPI Electronic, (ドイツ、タム)	NAの	NPI VA-10Mマルチチャンネルアンプベース
ドーパミンHCl	シグマ・アルドリッチ(ミズーリ州セントルイス)	H8502-10G
金メッキオスコネクタピン	AMP-TE コネクティビティ (Amplimite)	〒66506-1
HEKA LIH 8+8 アナログ-デジタル/デジタル-アナログデバイス	HEKA Elektronik、(マサチューセッツ州ホリストン)	NAの
Igor Proデータ収集ソフトウェア、v.7.08	WaveMetrics、(オレゴン州レイクオスウィーゴ)		ソフトウェア駆動コマンドの可能性とデータ取得はカスタムメイドで作成
Masterflex L / S標準デジタル蠕動ポンプ	コール・パーマー(イリノイ州バーノンヒルズ)
PFA被覆プラチナ線	AMシステムズ、(スクイム、ワシントン州)	773000	0.005 "裸の直径、0.008 "コーティングされた直径
シリコーンエラストマー	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(フロリダ州サラソタ)	SYLG184
合成ブタNPYペプチド	Bachem(カリフォルニア州トーランス)	4011654