海馬ニューロンにおけるグルタミン酸受容体輸送を研究するためのIn Vitro技術

要約

出典:Chiu, A. M., et al. 解離した初代海馬培養におけるグルタミン酸受容体の輸送を研究するための抗体供給アプローチ。 J. Vis. Exp.(2019年)

このビデオは、初代海馬ニューロン培養におけるグルタミン酸受容体の輸送を研究するための抗体栄養アプローチを示しています。このアプローチにより、血漿膜と内膜の両方で受容体集団を観察できます。これらのサブセット間の識別は、膜透過化の前後で、同じ一次抗体と異なる蛍光色素に結合した二次抗体を使用して受容体を標識することによって達成されます。

プロトコル

1. ラベリング前の準備

1. 初代海馬培養物の調製と維持
   1. 150,000細胞の密度で初代海馬培養物を調製し、ポリD-リジンコーティング(0.1 mg/mL)18 mmカバーグラスに播種します。解離神経細胞培養調製のための優れたガイドが利用可能です.
      手記：必要に応じて、培養物をシトシンアラビノシド(Ara-C、in vitro 1 [DIV1])で処理して、調製物中のグリア増殖を回避できます。
      手記： ポリ-D-リジンの代わりに、フィブロネクチン(1 mg/mL)やラミニン(5 μg/mL)などの代替コーティング試薬を使用することができます。
   2. B27および2 mM L-グルタミンを添加した神経基礎培地の2 mL/ウェル中、37 °Cおよび5% CO₂のセルインキュベーターで培養液を維持します
      手記： 必要に応じて、L-グルタミンの代替品(例:Glutamax)を使用することができます。
   3. 毎週、メディアの量の半分を取り外し、同じ量の補充された神経基礎メディアと交換します。
2. オプション:変異および/またはエピトープタグ付き受容体のトランスフェクション
   注:ニューロンは、受容体の発現を可能にするために、分析時点の少なくとも3〜4日前にトランスフェクションする必要があります。若いニューロン(DIV6-9)を使用すると、古いニューロン(DIV15-20)よりもトランスフェクション効率が高くなりますが、使用するDIVに関係なく、十分な数のトランスフェクション細胞(>20)を達成できます。
   1. 12ウェルプレートの各ウェルについて、目的のコンストラクトを含むプラスミド1.5 μgを、B27またはグルタミンを補給していない100 μLの新鮮な神経基礎培地で微量遠心チューブに希釈し、すばやくボルテックスして混合します
      手記：トランスフェクションを成功させるには、使用する神経基礎培地ができるだけ新鮮で、理想的にはボトル開封後1週間以内であることが重要です。
   2. 2本目の微量遠心チューブで、1 μLの適切なリポフェクション試薬を100 μLの新鮮な神経基礎培地に混合し、穏やかに混合します
      手記：リポフェクション試薬混合物をボルテックスしないでください。新鮮なリポフェクション試薬を使用すると、トランスフェクション効率を向上させることができます。
   3. チューブを室温(RT)で5分間インキュベートします。
   4. リポフェクション試薬混合物をDNA混合物に滴下し、穏やかに混合し、室温で20分間インキュベー
   トします。
   5. 各ウェル内の培地の量を1 mLのコンディショニング培地に調整します。
   6. リポフェクション試薬-DNA混合物をウェルに滴下します。
   7. 細胞をインキュベーターに戻し、タンパク質発現のために少なくとも3〜4日待ちます.
      手記：以下に概説するインターナリゼーションおよびリサイクルプロトコルの目的のために、海馬ニューロンをDIV11–12でトランスフェクションし、細胞外ドメイン(GFP-GluN2B)に緑色蛍光タンパク質(GFP)でタグを付けたGluN2Bを発現するコンストラクトをDIV15–16でイメージングしました。
3. オプション:固定されるまで、コンディショニング培地中で細胞を薬物(慢性または急性)とインキュベートします。
   注:急性期治療の場合は、標識する前に細胞の治療を開始してください。使用する薬物治療プロトコルに応じて、セクション2では細胞を薬物含有培地に保持することができます。この例では、DIV21細胞を化学的に誘導する長期増強(cLTP)プロトコルを適用して、表面発現α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸受容体(AMPAR)を増加させました。
   1. 細胞外溶液(ECS)用の馴化培地を交換します。
   2. 細胞をECS中の300 μMグリシンでRTで3分間処理します。対照として、姉妹カバースリップをECS(グリシンなし)で処理します。.
   3. 細胞を37°CのECSで3回洗浄し、ECS(グリシンを含まない)の細胞を細胞インキュベーターに20分間戻してから、セクション2.
      に進みます。 注:ECS(mM):150 NaCl、2 CaCl₂、5 KCl、10 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、30グルコース、0.001テトロドトキシン(TTX)、0.01ストリキニーネ、および0.03ピクロトキシン(pH 7.4)。

2. 表面発現受容体のライブ標識

1. ラベリング用のカバースリップを準備します
   1. 試薬を節約し、操作を容易にするために、カバースリップを細胞側を上にしてパラフィンフィルムで覆われたトレイに移します.
      注:サンプルを乾燥させないことが重要です。
   2. インキュベーションおよび洗浄ステップのために、コンディショニング培地を37°Cで保存および維持します.
      手記：18 mmのカバーガラスの場合、抗体標識には75〜100 μLの培地、インターナライゼーション/リサイクルには120〜150 μLの培地でのインキュベーションが推奨されます。
2. 一次抗体による表面受容体の標識
   1. 一次抗体をコンディショニング培地で希釈した細胞をRT.
      で15分間インキュベートします。 手記： GFPタグ付き受容体については、1:1000の希釈率のウサギ抗GFP抗体を使用しました。内因性GluA1については、1:200希釈のマウス抗GluA1を使用しました。
   2. 真空ピペットを使用して抗体含有培地を慎重に吸引し、コンディショニング培地で細胞を3回洗浄します
      手記：コンディショニング培地が利用できない場合は、PBS+ [1 mM MgCl₂ および 0.1 mM CaCl₂ を含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)] を使用して、すべての洗浄ステップを実行できます。マイクロピペットを使用した手動吸引は、穏やかな真空吸引が利用できない場合は実行できます。

3. 表面表現 (図 1)

1. 表面発現受容体の二次抗体標識
   1. PBS+で一度洗ってください。
   2. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)および4%スクロースとPBS溶液で7〜8分間インキュベートすることにより、細胞を固定します
      手記： メタノールインキュベーションなどの他の固定法とは異なり、PFAは原形質膜を透過しないため、表面発現分析に適しています。最適な結果を得るには、新たに調製したPFAを使用してください。PFAを4°Cで短期保存するか、-20°Cで長期(最大30日間)保存すると、適切な固定が可能です
      注意： PFAは発がん性物質として知られています。取り扱いの際は、適切な個人用保護具と安全フードを使用してください。
   3. 通常のPBSで細胞を3回洗浄します.
      手記： あるいは、PBSの代わりに0.1 MグリシンをPFAの洗浄に使用することもできます。これは、グリシンが調製物のバックグラウンドを増加させる可能性のある残留固定剤をクエンチするためです。
   4. PBS中の10%正常ヤギ血清(NGS)とRT.
      で30分間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックします。 手記： ブロッキング時間を延長しても、ラベリングに悪影響を与えることはありません。
   5. 蛍光標識二次抗体をPBS中の3% NGSで希釈し、室温で1時間インキュベートし、一次抗体標識受容体(すなわち、表面発現)を標識します
      手記：これらの例では、Alexa 555標識二次抗体を1:500に希釈して使用しました:GFP標識受容体にはヤギ抗ウサギ、GluA1にはヤギ抗マウスを使用しました。
   6. 細胞をPBS 3xで洗浄します。
2. 細胞内受容体の標識
   1. 0.25% Triton X-100 in PBSで細胞をRT.
      で5〜10分間透過処理します。 手記： 抗体標識の最初のラウンドがすべての表面エピトープを占めていることを確認するために、この透過化ステップを姉妹培養でスキップできます。この場合、細胞内受容体のシグナルは得られません。さらに、前のセクション2で標識された内部受容体がないこと(すなわち、培養中の原形質膜の完全性を示すこと)を確認するために、姉妹培養では透過化ステップをスキップし、細胞内タンパク質(例えば、シナプス後密度タンパク質95[PSD-95]または微小管関連タンパク質2[MAP2])に対する一次抗体をステップ2.2.1で利用することができる。これらの条件下では、このプライマリーからシグナルを取得しないでください。この場合、ウサギ抗PSD-95抗体(1:500)を使用しました。
   2. PBS中の10% NGSでRTで30分間ブロックします。
   3. 透過処理した細胞を、セクション2.2で使用したのと同じ一次抗体とインキュベートし、PBS中の3% NGSで希釈し、RT.
      で1時間インキュベートすることにより、細胞内受容体を標識します。 手記：細胞内受容体を標識するための抗体希釈は、表面発現受容体の標識に必要な希釈とは異なる場合があります。GluA1の例では、同じ抗体希釈率(1:200)を使用しました。
   4. 細胞をPBSで3回洗浄します。
   5. 2番目の蛍光タグ付き二次抗体をPBS中の3%NGSで希釈し、RT.
      で1時間希釈した標識 手記：これらの例では、1:500 に希釈したヤギ抗マウス Alexa 647 標識二次抗体 (GluA1 用) を使用しました。
   6. 細胞をPBSで3回洗浄します。

4. 内在化 (図 2)

1. 抗体標識表面受容体のインターナリゼーション
   1. 表面発現受容体の標識と抗体の洗浄(セクション2.2)の後、抗体を含まないコンディショニング培地で細胞を維持し、インキュベーター(37°C)に戻して内部化を可能にします><。 注:N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)受容体の場合、内部化に30分が推奨されます。.対照として、姉妹培養物は、内在化プロセス中に4°Cのコンディショニング培地で維持することができます。これらの条件下では、受容体の内在化が最小限に抑えられるはずです。
2. 表面受容体の標識
   1. 細胞をPBS+で一度洗浄します。
   2. 細胞を PBS 中で 4% PFA と 4% スクロースで 7–8 分間固定します
      注意：PFAを取り扱うときは、適切な個人用保護具と安全フードを使用してください。
   3. 通常のPBSで細胞を3回洗浄します。
   4. PBS中の10% NGSを室温で30分間ブロックし、非特異的結合を防止します。
   蛍光
   5. 標識二次抗体をPBS中3% NGSで希釈した蛍光標識二次抗体とサンプルをインキュベートし、RTで1時間インキュベートし、一次抗体標識受容体(すなわち、内在化されていない表面発現受容体)を標識します
      手記：この例では、Alexa 555標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:500)を標識に使用しました。
   6. 細胞をPBSで3回洗浄します。
3. 内在化受容体の標識
   1. 0.25% Triton X-100をPBS中で5〜10分間細胞を透過処理します。
   2. 10% NGSのPBSを室温で30分間インキュベートすることにより、非特異的結合をブロックします。
   3. 蛍光標識二次抗体をPBS中3% NGSで希釈したサンプルをRTで1時間インキュベートし、内在化抗体標識受容体を標識します
      手記：この例では、Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit secondary antibody (1:500) を標識に使用しています。
   4. 細胞をPBSで3回洗浄します。

5. リサイクル(図3)

1. 抗体標識表面受容体のインターナリゼーション
   1. 表面発現受容体の標識と抗体の洗浄(セクション2.2)の後、抗体を含まないコンディショニング培地で細胞を維持し、インキュベーター(37°C)に戻して内部化を可能にします><。 注:NMDA受容体の場合、内在化に30分が推奨されます。
2. 安定な表面発現受容体のブロッキング
   1. 表面発現受容体に付着した一次抗体のエピトープをブロックするには、コンダクションされていないFab抗IgG(H+L)抗体フラグメント(セクション2.2で使用した一次抗体に対して)をコンディショニング培地(20 μg/mL)で希釈し、室温で20分間インキュベートします。この治療により、二次抗体との将来の相互作用が防止されます
      手記：この例では、ヤギの抗ウサギFabフラグメントが使用されました.
      手記：対照実験:表面発現受容体の完全なブロッキングが起こったことを確認するために、Fabの有無にかかわらず、姉妹カバースリップをインキュベートすることができます。培養物はFab処理後すぐに固定し、両方の培養物をAlexa 555標識二次抗体とインキュベートします。Fabインキュベートした細胞にAlexa 555シグナルはなく、抗体が適切にブロッキングされていることを示しています。
   2. 細胞をコンディショニング培地で3回洗浄します。
   3. 80 μM Dynasoreを含む馴化培地で細胞をインキュベートしてさらなる内在化を防ぎ、細胞をインキュベーター(37°C)に戻して内在化受容体のリサイクルを可能にします。ダイナソールは、ダイナミンを阻害し、それにより内在化を防ぐGTPase阻害剤です
      注:NMDARのリサイクルには45分をお勧めします。Dynasoreは、ダイナミン依存の内部化プロセス(NMDARの内部化など)を排他的にブロックすることに注意してください。ただし、他のシナプスタンパク質(ダイナミン非依存性)の内在化は、Dynasoreの存在下でも発生する可能性があります。
3. リサイクルされた受容体のラベリング
   1. 細胞をPBS+で一度洗浄します。
   2. 細胞を PBS 中で 4% PFA と 4% スクロースで 7–8 分間固定します
      注意： PFAを取り扱うときは、適切な個人用保護具と安全フードを使用してください。
   3. 細胞をPBSで3回洗浄します。
   4. PBS中の10% NGSを室温で30分間ブロックし、非特異的結合を防止します。
   5. PBS中の3% NGSで希釈した最初の蛍光標識二次抗体をRT.
      で1時間標識します。 手記：この例では、Alexa 555標識ヤギ抗ウサギ抗体(1:500)を標識に使用しました。
   6. 細胞をPBS.
      で3回洗浄します 手記：PBSによる長時間の洗浄(5〜10分)は、調製のバックグラウンドを減らすのに役立つ場合があります。
4. 内在化受容体の標識
   1. 0.25% Triton X-100をPBS中で5〜10分間細胞を透過処理します。
   2. PBS中の10% NGSでRTで30分間ブロックします。
   3. 2番目の蛍光タグ付き二次抗体をPBS中の3%NGSで希釈し、RT.
      で1時間希釈した標識 手記：この例では、Alexa 647-conjugated goat anti-rabbit antibody (1:500) を標識に使用しました。
   4. 細胞をPBSで3回洗浄します。

>6. サンプルの埋込みとイメージング

1. セルのマウントには、カバースリップセルを下にして、12〜15 μLの適切な封入剤にそっと置きます。
   手記： 過剰な封入剤を吸引することで、画像の品質が向上します。
2. 適切な共焦点顕微鏡で細胞を画像化.
   手記： zスタックは、ニューロンの全厚さを網羅する0.35μmステップで60倍の倍率でイメージングすることをお勧めします。

>7. 時間に関する考慮事項

1. これは、いくつかのポイントで停止できる長いプロトコルです。必要に応じて、ブロッキングおよび一次抗体のインキュベーションステップを、湿度の高いチャンバー内で4°Cで一晩中実施します。
2. あるいは、必要に応じて、マイクロ波ティッシュプロセッサーを使用して、固定後のインキュベーション時間を大幅に短縮します。すべての手順で、「オン」設定には30°Cで150Wを使用します。​
   1. ブロックするには、プロセッサを 2 分で "オン"、1 分で "オフ"、2 分で "オン" で実行します。
   2. 一次抗体および二次抗体のインキュベーションステップでは、プロセッサーを3分間「オン」、2分間「オフ」、3分間「オン」で実行します><。 注:上記のプロトコルの変更を行っても品質に違いは見られません。

8. 画像解析

1. 画像分析を行うには、複数のファイル形式と互換性があるため、FIJI を使用することをお勧めします。データには、Nikon ND2ファイル形式の画像を取得しました。
2. FIJIによって事前に選択されたさまざまなパラメータのバッチ定量を容易にするためのマクロスクリプトが用意されています。マクロには、次の手順が含まれています:
   注:これらの例では、「積分強度」を測定しました。
3. FIJIで画像ファイルを開き、チャネルを分離します。
4. 各チャンネルスタックを最大強度投影としてZ投影します。
5. 各チャネルのしきい値を低く設定します.
   注:閾値は、各実験データセットについて経験的に決定する必要があります。各チャネルに個別の下限しきい値を設定できますが、同じデータセットのすべての画像に対してチャネルしきい値を一貫して維持することが重要です。
6. 3 つから 5 つの 2 次または三次樹状突起を選択し、関心領域 (ROI) として保存します。
7. 表面チャネルおよび細胞内チャネルにおける各ROIの積分密度を測定します。
8. 表面チャネルの積分密度値を細胞内チャネルで割ることにより、各 ROI の信号を正規化します。
9. すべてのコントロール画像と実験画像について測定を繰り返し、実験値をコントロール値(例:GluN2B WTまたは非グリシン条件)に正規化します。

結果

図1:cLTPはGluA1の表面発現を増加させます。 DIV21の初代海馬ニューロンを、グリシン含有ECSとインキュベートすることにより、化学的LTP(cLTP)にさらしました。表面発現(赤)と細胞内(青)のGluA1集団の標識を明確にすると、AMPARの表面発現の増加が予想されます。(A)シングルプレーンおよび(B)Zスタック(最大強度投影)共焦点画像。スケールバー = 50 μm (細胞全体) または 5 μm (樹状突起)。グラフは、cLTPプロトコール後のGluA1の表面発現の増加を示しています。表面発現指数:表面/細胞内受容体(n = 3、細胞数:con = 7、cLTP = 7、値はSEM±平均を表し、Mann-Whitney U検定を使用した場合、****p < 0.0001)。(C)

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
直径18mm#1.5厚のカバーグラス	ニュービトロ	GG181.5
Alexa 555-共役ヤギ抗マウスセカンダリ	ライフテクノロジー	A21424 (英語)
Alexa555コンジュゲートヤギ抗ウサギセカンダリ	ライフテクノロジー	A21429 (英語
Alexa 647共役ヤギ抗マウスセカンダリ	ライフテクノロジー	A21236(英語)
Alexa 647共役ヤギ抗ウサギセカンダリ	ライフテクノロジー	A21245(英語)
B27	ギブコ	17504044
CaCl2	シグマ	C7902
Corning Costar フラットボトム細胞培養プレート	コーニング	3513
ダイナソール	トクリス	2897
グルコース	シグマ	G8270
グリシン	トクリス	219
ヤギの抗ウサギFabの破片	シグマ	SAB3700970
ヘープス	シグマ	H7006-J
KClの	シグマ	P9541
L-グルタミン	シグマ	G7513
リポフェクタミン 2000	インビトゲン	11668019
マウス抗GluA1抗体	ミリポア	MAB2263
NaCl	シグマ	S6546
神経基礎メディア	ギブコ	21103049
NGSの	アブカム	AB7481
パラフィルム	ビーミス	PM999
PBSの	ギブコ	10010023
ペルコバイオウェーブ	テッド・ペラ	36500
PFAの	アルファ・アエサル	43368
ピクロトキシン	トクリス	1128
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩	シグマ	P7280
ProLong Gold 退色防止マウンタント	ライフテクノロジー	P36934
ウサギ抗GFP抗体	インビトゲン	A11122 (英語)
ウサギ抗PSD-95抗体	細胞シグナル伝達	2507
ストリキニーネ	トクリス	2785
蔗糖	シグマ	S0389
Superfrost と顕微鏡スライド	漁夫	12-550-15
トリトンX-100	シグマ	X100
TTXの	トクリス	1078

の ) さん 名 名 の 名 型 の シリーズ の 名 型 名 名 名