サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. ターゲットマイクロスフェアの準備
- 関連する標的抗原を選択してください.
手記：この例では、ネイティブHIVエンベロープの三量体頂点を模倣するように設計された組換えタンパク質V1V2-2F5Kを使用しました。
- 市販のキット(Table of Materials)を使用して、製造元のプロトコルに従ってビオチン化を行います。
次の- 式を使用して、反応に追加するビオチン試薬のミリモルを計算し、5倍モル過剰になります:mmol ビオチン = mL タンパク質 x (mg タンパク質/mL タンパク質) x (mmol ビオチン/mg タンパク質) x (5 mmol ビオチン/mmol タンパク質)。次に、次式を使用して添加するビオチン試薬のμLを計算します:μLビオチン= mmolビオチンx(1,000,000μL / L)x(L / 10mmol)。
- ビオチンを室温まで平衡化してから開封してください。上記の計算に従って、タンパク質を0.5-2.0mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解します。
- ビオチン試薬の10 mM溶液をジメチルスルホキシド(DMSO)に調製し、タンパク質溶液に適量の10 mMビオチン試薬を加え、氷上で2時間または室温で30分間インキュベー
トします。
- タンパク質濃縮器(ポリエーテルスルホン[PES]メンブレン、3 kDa分子量カットオフ[MWCO]、0.5 mL;資料表)製造元の指示に従って。
- スピンカラムの上部チャンバーにサンプルを沈殿させ、PBSを最大400μLまで加えます。12,000 x g、室温で30分間遠心分離します。
- フロースルーを廃棄し、PBSを400 μLに加え、遠心分離を繰り返します。フロースルーを捨て、PBSを100 μLに加え、分光光度計でタンパク質濃度を測定します
手記：タンパク質は、使用するまで-80°Cで分注および凍結できます。
>2. 抗体依存性細胞貪食症(ADCP)アッセイプレート調製
- ビオチン化タンパク質を1 μmのマイクロスフェア(「ビーズ」;資料表)製造元の指示に従って。
- 標識ビーズ1プレートあたり、6 μgのタンパク質と12 μLのストックビーズを200 μLの0.1%ウシ血清アルブミン(BSA)-PBSに室温で1時間インキュベートし、20分ごとに穏やかにボルテックスします。
- 13,000 x gで5分間遠心分離し、上清を捨て、穏やかにボルテックスして、0.1% BSA-PBSの1200 μLに再懸濁します。スピンと洗浄のステップを2回繰り返します。0.1% BSA-PBSの1200 μLに再懸濁します。
- 丸底の96ウェルプレートにウェルあたり10 μLのビーズ溶液を分注します。12 μL の 2% HSA HBSS で、抗体または目的の免疫血清を希釈液として調製します (通常は 50 μg/mL の抗体または 1/100 の血清希釈液から開始< br />
手記：サンプルデータでは、モノクローナル抗体(mAb)830Aを使用しました。
- 10 μLの滴定抗体/血清をビーズプレートに加え、37 °Cで2時間インキュベートし、200 μLの2% HSA HBSSを各ウェルに加え、プレートを2,000 x gで10分間遠心分離します。
- 目に見えないビーズペレットを邪魔しないように、プレートウェルから液体を急速に逆転させてシンクにデカントすることにより、上清を慎重に取り除きます。
3. 母乳細胞の分離
- 健康な授乳中の女性から、二重の電子ポンプまたは手動ポンプを使用して搾乳されたヒト母乳を採取します。搾乳から~4時間以内に細胞を分離し、牛乳を室温に保ちます。
- 50 mLチューブを使用して、50 mLの牛乳を800 x gで15分間遠心分離します。スキムミルクと脂肪を慎重に注ぎ、細胞ペレットを乱さずに放置します。糸くずの出ないワイプでチューブの内側を拭き取り、チューブの壁から脂肪をすべて取り除きます。
- 10 mLの2%ヒト血清卵白をハンク平衡食塩溶液(2% HSA HBSS [Ca2+またはMg+なし])に加えます。.細胞の活性化とアポトーシスを避けるために、穏やかなピペッティングでペレットを再懸濁します。15 mLチューブに移し、450 x gで10分間遠心分離します。
- 上澄みを注ぎ、手順1.3を繰り返します。次に、予想される細胞数に応じて、1-2 mLの2% HSA HBSSに細胞を穏やかに再懸濁し、血球計算盤または自動セルカウンターで細胞をカウントし、細胞生存率にも注目します。
4. ADCPアッセイ
>注:ここで説明する方法は、Ackermanらから採用されています。
- 200 μL の 2% HSA-HBSS 中で、単離した 50,000 個の新たに分離した BM 細胞を各 ADCP アッセイプレートウェルに添加します。37°Cで2時間インキュベートします。
- コントロール実験では、10 μg/mL アクチン阻害剤(サイトカラシン-D)、50 μg/mL Fc 受容体ブロッキング剤(FcBlock)、または両方の組み合わせを使用して 37 °C で細胞をプレインキュベートしてから、プレートに添加します。
- 930 x gで10分間プレートを遠心分離し、200 μLの2% HSA HBSSを加えて遠心分離を繰り返します。ステップ2.7のように上清を慎重に取り除き、洗浄を繰り返します。
- 2% HSA HBSSの50 μLにウェルあたり0.5 μg/mL(最終濃度)の固定生存率染色剤450を使用して、上清と染色細胞を慎重に除去して生存率を高めます。暗所で室温で20分間インキュベートします。プレートを930 x gで10分間遠心分離し、ステップ2.7のように上清を除去します。200 μL の 2% HSA HBSS と遠心分離プレートを再度追加し、ステップ 2.7 と同様に上清を除去します。
- 生存率染色後、PEマウス抗ヒトCD45(クローンHI30)などのCD45特異的染色を最小限に含めて、目的の白血球マーカーの細胞を最適な濃度(例題のデータでは1% BSA HBSSの50μLに1 μg/μL)で染色します
手記： 関心のある系統固有のマーカーを含めることができます。
- 暗所で室温で20分間インキュベートします。プレートを930 x gで10分間遠心分離し、ステップ2.7のように上清を除去します。1% BSA HBSSを200 μL加え、遠心分離を繰り返します。上清を取り除きます。0.5%ホルムアルデヒドの200μLに細胞を室温で30分間、または4°Cで一晩固定します。
>5. フローサイトメトリーによる解析
- 初期ゲーティングを実行して、前方散乱 (FSC) 対側散乱 (SSC) プロットのダブレットと破片 (FSC = 5000 より小さい材料) を排除します (図 1 を参照)。SSC対生存率染色(この場合はV450)プロットを使用して、死細胞(生存率染色陽性の細胞)を排除します。
- SSC対CD45プロットを使用して、広く説明されているように主要な白血球クラス(顆粒球、単球、リンパ球)を区別します。
手記： この分類は示唆に過ぎず、細胞タイプを確認するためには系統特異的なマーカーが必要です。
- すべてのCD45+細胞、または目的の各白血球サブセットについて、蛍光ビーズが検出されるフルオレセインイソチオシアネート(FITC)チャネルのヒストグラムでビーズ陽性細胞にマーカーをゲーティングすることにより、ADCP活性を測定します
手記：ビーズが添加されなかったネガティブコントロールウェルは、ビーズ陽性細胞がヒストグラムのどこに見えるか、したがってゲーティングマーカーを配置する場所を示します。
- ADCP スコアを (ビーズ陽性細胞の蛍光強度 [MFI] の中央値) x (陽性集団内の全 CD45 + 細胞の割合) として計算します。グラフィックソフトウェアを使用して、各Ab/血清濃度のスコアをプロットし、曲線下面積(AUC)分析を実行します。
手記：ADCP は、AUC が非特異的ネガティブ コントロール mAb の ADCP スコア AUC の標準偏差の 3 倍より大きい場合 (この場合は 3865) 陽性と見なされます。
