動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. マウス脾臓からの免疫細胞の調製
注:ナイーブマウスを二酸化炭素(CO2)安楽死で安楽死させます。ジャクソン研究所から購入し、自社で飼育したC57BL/6マウスを6-12週齢の実験に用います。実験にはオスマウスとメスマウスの両方を利用します。
- マウスの皮膚を70%エタノールで消毒し、外部からの汚染物質がサンプルに侵入する可能性を減らします。
- 解剖ツール、手術用ハサミ、および鉗子を使用してマウスの脾臓を解剖します。脾臓を採取し、剥離した脾臓を50mLの円錐管に入れ、氷上に~5mLの完全なロズウェルパーク記念研究所培地(cRPMI)を入れます。
手記：完全 RPMI は、10% ウシ胎児血清 (FBS)、2 mM L-グルタミン、および 1% ペニシリン/ストレプトマイシンで構成されています。
- マウスの脾臓を採取するには、ハサミでマウスの左側に沿って前足と後ろ足の中間に毛皮と皮膚に5cmの切開をします。体腔を~5cm開き、鉗子を使用して脾臓を切除します。脾臓はインゲン豆の色をしており、隣接する腎臓よりも長くて平らです。
- ステップ 1.2 の内容物を、新しい 50 mL コニカルチューブに取り付けた滅菌済み 70 μm フィルターに注ぎます。フィルター表面に脾臓パルプが残らなくなるまで、5 mLシリンジプランジャーで脾臓をフィルターに押し込み、脾臓を単一細胞懸濁液に機械的に分離します。
- スイングアウトローターカウンタートップ遠心分離機を使用して、500 x gで4°Cで5分間脾臓細胞をペレット化します。
- 上清を慎重にデカントします。ペレット化された脾臓細胞は、50mLのコニカルチューブの底に残ります。
- 赤血球を除去するには、ペレット化した脾臓細胞を1 mLのアンモニウム-塩化-カリウム(ACK)溶解バッファーに3分間再懸濁します。よく混ぜます。
- ACK溶解バッファーを15 mLのcRPMIでクエンチします。
- ステップ1.4の指示に従ってリンパ球をペレット化します。
- 細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブ内の5 mLのcRPMIに再懸濁します。サンプルを氷の上に置きます。
- 細胞をカウントするには、細胞懸濁液10 μLを0.6 mLの微量遠心チューブに移し、トリパンブルー溶液で1:1の比率で希釈します。その後、血球計算盤または自動細胞計数システムに移します。
- カウント後、ステップ1.9のように細胞懸濁液中の細胞濃度に応じて、500 x g、4°Cの卓上遠心分離機で細胞をペレット化し、Indo-1 AMエステル色素を含むcRMPI培地を添加する準備をします。
- 細胞の再懸濁液の量を計算して、10-12 x 106細胞/mLを達成します。これは、必要な総細胞数の2倍の濃度です。
- ステップ1.11で計算したcRPMIのボリュームにセルを再懸濁します。細胞を5% CO2で37°Cに置き、蓋を通した50 mLコニカルチューブまたは組織培養プレートに入れます。
2. Indo-1レシオメトリック色素と蛍光抗体の標識
- 製造元の指示に従って、50 μgのIndo-1 AMが入ったバイアルに50 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えます。原液の濃度は1μg/μL.
です。
手記：DMSOは、DMSOの酸化を防ぐために、キットに付属するマイクロバイアルで提供されます。
- ストックアリコート (1 μg/μL) を cRPMI の適切な実験量 (1.11 で確立) に希釈し、6 μg/mL の濃度、2 倍の濃度で Indo-1 を水溶液に保管しないでください。
手記：カルシウムを添加した他のバッファーは、細胞のニーズに応じて使用できます。
- Indo-1を含む完全な培地を37°Cの水浴に置き
手記：適切なシグナルを得るために必要な最小濃度のIndo-1 AMエステルを使用してください。これは、さまざまな細胞タイプに対して滴定する必要があります。通常、3〜5μMの濃度で十分です。初代T細胞の場合、Indo-1を濃度>5 μg/mLで細胞にロードすると、スペクトルフローサイトメーターで平均蛍光強度(MFI)がlog6を超えて増加します。これが発生した場合は、紫外線(UV)レーザー強度を下げ、Indo-1を低濃度に滴定します。
- ステップ1.12で調製した細胞懸濁液を、ステップ2.2で調製した2x Indo-1培地を含むcRPMIで1:1に希釈します。細胞が5-6 x 106 / mL.
の濃度にあることを確認してください
手記：未染色のシングルステインコントロールまたは表面マーカーのシングルステインセルコントロールをIndo-1で染色ロードしないでください。Indo-1をシングルステイン抗体コントロールに添加すると、シングル染色細胞にIndo-1を添加することでマルチカラーサンプルが作成されます。ステップ 2.6 で作成したサンプルプレートに indo-1(カルシウムフリー)エチレングリコール四酢酸(EGTA)添加コントロールを含めます。
- 1 mLの細胞/ウェル/実験条件を12ウェル組織培養プレートに加えます。
- 以前にIndo-1色素を充填した細胞を使用して、Indo-1(カルシウムフリー)サンプルの染色済みコントロールを1つ作成し、EGTAを最終濃度2 mMまで添加します。EGTAは細胞懸濁液中のカルシウムをキレート化し、よりクリーンなコントロールサンプルを提供します。
- フローサイトメーターで色素をロードした細胞懸濁液に50 μMのイオノマイシンを添加することにより、Indo-1ポジティブコントロール(Indo-1カルシウム結合)を作成します。イオノマイシンは、カルシウムイオンを結合し、カルシウムイオンの細胞内への移動を促進する膜透過性カルシウムイオノフォアです。
- 蛍光色素やIndo-1色素を含まない生物学的ネガティブコントロール用のウェルを作成します。
- フローサイトメトリーパネルデザインで抗体標識蛍光色素を使用して、目的の追加の細胞集団(抗体ユーザー定義)の単一染色コントロール用のウェルを作成します。これらには、Indo-1レシオメトリック染料は含まれません。
- 表面染色用の蛍光色素標識抗体を追加する前に、製造元の指示に従ってFc受容体ブロッキング抗体(~2 μg/1 x 106細胞)を添加してください。
- プレートを5% CO 2と共に37°Cで45分間インキュベートします。
- 12ウェルプレートに15分ごとにプレートを軽くたたいて、細胞を再懸濁します。
- 培地に懸濁した細胞の全量を12ウェルプレートから混合し、除去します。次に、細胞懸濁液を1.7 mLの微量遠心チューブに加えます。
- 細胞を500 x gの微量遠心分離機で室温で5分間ペレット化します。上清をデカンタントし、予め温めたcRPMI1 mLを加えて細胞を洗浄します。再度ペレット状にし、上清をデカントします。
手記：細胞を洗浄すると、残っているFcブロッキング抗体が除去されます。
- 1.7 mLの微量遠心チューブに細胞を1 mLのcRPMIに再懸濁し、各チューブを37°Cで5% CO2でさらに30分間インキュベートし、チューブの上部をわずかに開いてガス交換を可能にします。これにより、細胞内AMエステルの完全な脱エステル化が可能になります。
- 必要に応じて、細胞を12ウェル組織培養プレートに戻します。追加のユーザー定義滴定型蛍光色素標識抗体は、休止期に添加できます.
手記：メソッドパネルで使用されるマーカーには、Ghost 540、CD4、CD8、TCRβ、TCRγδ、CD25、およびCD1d/α-ガルサー四量体が含まれます。マーカーは、T細胞サブセットを解析するために選択されます。
- 目的の細胞タイプに応じたすべてのユーザー定義蛍光色素標識抗体のマスターミックスを、以前に滴定した容量で1.7 mLの微量遠心チューブに作成します。
- 休止細胞に対する滴定抗体に依存する細胞容量1 mLの計算済みマスターミックスを添加します。
手記：ステップ2.18ではなくステップ2.15で染色する利点は、ステップ2.15で染色することで、実験の全体的なインキュベーション時間が短縮されることです。しかし、ステップ2.15で総量1 mLを染色すると、抗体の使用量が増加します。
- 休息後、細胞を500 x gで室温で5分間ペレット化します
手記：12ウェル組織培養プレート内の細胞は、プレート遠心分離機アクセサリーを使用してプレート内でペレット化できます。それ以外の場合は、1.7 mLの微量遠心チューブに細胞をペレット 化します。
- ペレットを1 mLの4°C冷cRPMIに再懸濁して細胞を洗浄し、ステップ2.16と同様に細胞を再度ペレット化します。細胞を氷の上に置きます。
手記：ステップ2.18で脱エステル化した後、細胞を別々に表面染色する場合、必要な抗体量は少なくなります。このステップでの表面染色は、コールドフローバッファー(1x Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に1% FBSを添加したもの)の休止期後に、ユーザー定義の抗体を使用して氷上で30分間行うことができます。ステップ2.17のように、cRPMIで染色後の細胞を洗浄します。
- DPBSで1:7,500に希釈した生存率染色剤Ghost540を、製造元の指示に従ってサンプルに加えます。熱は、単一の染色された生/死を制御するための加温ブロック上の55°Cで細胞を死滅させます。
手記：フローサイトメトリー解析で死細胞を除去する生存率機能性色素染色は、FBSを使用せずに行われます。FBSは、製造元の指示に従ってアミン染料と相互作用することができます。
- キャップ付きの5 mLポリスチレンフローチューブを使用して、個々のサンプルを500 μLのcRPMI(フェノールレッドフリー)に再懸濁します><。
手記：細胞は4°Cで最大1時間放置できます。
- 細胞を含む5 mLチューブごとに個別に、ビーズバスを使用して37°Cまで温めてから7分間、フローサイトメーターで分析し、サンプル間で時間を一定に保ちます。タイマーを使用します。
3. ビーズバスチューブ:カルシウムフラックス分析中の温度維持
- 水を加えない小さなウォーターバスにバスビーズを加え、37°Cまで温めます。
- 50 mLの円錐形チューブを、25 mLのマークでカミソリの刃で慎重に半分にカットし、チューブの上部を捨てます。
- 半分に切ったチューブの3/4をバスビーズで満たします。
- 手順3.2で作成したチューブを、手順3.1で作成したビードバスに入れます。チューブとビーズを37°Cに持って行きます。
- ビーズバスをフローサイトメーターの横のコンセントに差し込んで、サンプル分析の準備のために温度を維持します。
- フローサイトメーターでの実行中にチューブを所定の位置に配置するために、1つのチューブを保持するためにカットされた50 mLの円錐形発泡スチロールラックを追加します。これにより、曲線解析の間、チューブを手動で保持する必要がなくなります。
