ヒトノロウイルスVLPの腸内細菌への結合を定量するアッセイ

要約

出典:Madrigal, J. L., et al. Quantifying Human Norovirus Virus-like Particles Binding to Commensal Bacteria Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオでは、ヒト腸内細菌に結合するヒトノロウイルス様粒子(VLP)を定量するためのアッセイを実演しています。細菌懸濁液をVLPと混合し、インキュベートしてVLP-細菌複合体の形成を可能にします。次に、複合体を蛍光色素でタグ付けされたVLP特異的抗体で標識し、続いてフローサイトメトリーに基づく可視化と定量を行い、VLP結合細菌の割合を特定します。

プロトコル

1. VLP細菌付着アッセイ

>注意:ヒトノロウイルスVLPはバイオセーフティレベル(BSL)-2の危険性があり、VLPに関連するすべての作業はバイオセーフティキャビネットで実行する必要があります。アタッチメントアッセイ前の細菌培養物の調製は、生物に適した安全条件を使用して行う必要があります。

1. 試薬調製
   1. 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)
      1. 10x PBSを1 Lの脱イオン水1 Lに溶かして、1 LのPBSを調製します。
      2. オートクレーブ溶液を30分間。
      3. 上記の溶液を脱イオン水で1:10に希釈して、1x溶液を調製します。
      4. フィルターは、溶液を0.22μmのフィルターに通し、室温で保存することにより、溶液を滅菌します。
   2. 5%BSAの
      1. 5 gのウシ血清アルブミン(BSA)粉末を100 mLのPBSに加えて、5%(w / v)溶液を生成します。.
      2. 攪拌板にボルテックスするか、金属製の攪拌器を使用して、塊が溶解するまで溶液を混合します。
      3. 0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌します。
      4. 溶液は4°Cで保存します。
   3. フローサイトメトリー染色バッファー(FCSB)
      1. 0.22 μmフィルターを通して購入したFCSB(材料の表を参照)をフィルターします。
      2. 残りの溶液は4°Cで保存します。
   4. 5% ブロッキング バッファー (BB)
      手記：毎回新鮮なものを準備します。
      1. 0.5 gのBSAを10 mLの滅菌FCSBに加えます。.
      2. ボルテックスでサンプルを十分に混合し、使用するまで氷上に置いておきます。
2. 抗体標識
   1. 製造元の指示に従って、R-PE抗体標識キットを使用して、ヒトノロウイルスGII抗体(材料表を参照)をr-フィコエリトリン(PE)と結合させます(材料表を参照)。
   2. 標識抗体は、将来VLP細菌付着アッセイ分析で使用するために、4°Cの暗所で保存してください.
      手記：一次抗体は、VLP細菌付着アッセイで使用する前に滴定し、フローサイトメトリー解析に必要な適切な濃度を決定する必要があります。抗体滴定は、標識反応を行うたびに、およびアタッチメントアッセイで使用する各細菌に対して行う必要があります。
3. 抗体滴定
   1. 標識抗ヒトノロウイルスGII抗体を、開始希釈を1:100、終了希釈を1:600(合計6希釈)して100倍に希釈します。
   2. 以下の例外を除いて、以下に説明するようにウイルス付着アッセイを実施します:ステップ1.5.7で、細菌ペレットを5%BBの350μLに再懸濁します。
   3. サンプルを7つの50μLアリコートに分割します。
   4. 各抗体希釈液50μLを1本のチューブに加えます。
   5. 50 μL の 5% BB を 7 本目のチューブに未染色のコントロールとして加えます。
   6. 以下に説明するように、すべてのサンプルでフローサイトメトリーを実施します。
   7. 希釈した抗体サンプルを未染色のコントロールと比較し、また互いに比較します。その後のアッセイでは、陽性シグナルの減少または損失をもたらさない最も低い抗体濃度を選択する必要があります。
4. バクテリアの調製
   1. バクテリアが固定相になるまで、適切な大気条件下で40mLの適切な液体培地でバクテリアを増殖させます。
      1. Enterobacter cloacaeの培養物を、37°CのLuria Brothで一晩中好気的に培養し、200rpmで振とうして固定相に到達させます。
      2. De Man、Rogosa、およびSharpe(MRS)ブロスで、37°Cに設定された水浴で18時間振とうせずに、黒色のスクリューキャップチューブでLactobacillus gasseri培養物を増殖させ、固定相に到達させます。
   2. 固定相培養物を50 mLのコニカルチューブに移送し、サンプルを2,288 x gで10分間遠心分離してバクテリアをペレット化します。
   3. 上清を取り除き、滅菌した1x PBSの13 mLに再懸濁します。この洗浄手順を合計2回の洗浄を繰り返します。
   4. サンプルを再度遠心分離し、上清を取り除き、サンプルを1x PBS.
      20 mLに再懸濁します。 手記： 細胞ペレットが小さければ、再懸濁量を減らすことができます。
   5. 培養物の_OD600を測定します。
   6. 標準曲線を使用して、洗浄した培養物のmLあたりのコロニー形成単位(CFU)を決定します。
   7. バクテリアを1x PBSで希釈して、培養濃度を1 x 10⁸ CFU / mLに調整します。
   8. 1 x 10⁸ CFU/mL細菌培養物1 mLを必要な1.5 mL遠心チューブに移します。
   9. チューブを10,000 x gで5分間遠心分離します。
   10. 細菌ペレットを滅菌5%BSAの1mLに再懸濁します。
   11. チューブを37°Cで1時間インキュベートし、一定の回転を続けます。
5. ウイルスの添付ファイル
   1. BSL-2バイオセーフティキャビネット内で作業し、PBSに再懸濁された細菌を含む各チューブに10μgのヒトノロウイルス(HuNoV)VLP(材料の表を参照)を追加し、ピペッティングで完全に混合します><。 手記：VLP濃度はVLP調製ごとに異なります。したがって、バクテリアに添加される量は調製バッチによって異なるため、実験の各チューブに10 μgが添加されるようにそれに応じて調整する必要があります。細菌のみのコントロール(VLPを含まないサンプルなど)の場合は、実験サンプルに添加するVLPの量と等しい量のPBSを追加します。
   2. チューブを37°Cで1時間インキュベートし、一定の回転を行います.
      注:インキュベーション中は、40 rpmに設定されたチューブリボルバー(材料の表を参照)が使用されます。
   3. インキュベーション後、サンプルを10,000 x gで5分間遠心分離します。
   4. 上清を捨て、細菌ペレットをPBS1 mLに再懸濁します。.
   5. 洗浄手順1.5.3と1.5.4を繰り返します。
   6. サンプルを10,000 x gで5分間遠心分離します。
   7. 上清を捨て、バクテリアペレットを5%BBの150μLに再懸濁します。
6. 抗体染色
   1. 新鮮な5%BB.
      を準備します 注:蛍光標識抗体を使用するすべての作業は暗所で行い、抗体、BB、およびFCSBは氷上に保管する必要があります。
   2. ヒトノロウイルスGII抗体をE. cloacaeサンプル用に1:125、L. gasseriサンプル用に1:150を5% BBで希釈し、サンプルあたり50 μLの希釈抗体を調製します。
   3. ヒトノロウイルスGII抗体を各細菌について5% BBで希釈したのと同じ方法でアイソタイプ抗体を希釈し、サンプルあたり50 μLの希釈アイソタイプコントロールを調製します。
   4. ステップ 1.3.7 の各アタッチメントアッセイサンプルを 3 つの 50 μL アリコートに分割し、それらをクリーンな 1.5 mL 遠心分離チューブに移します。
   5. 最初のサンプルセットに、50 μLのBBを加えます。このセットは、汚れていない(Uns)コントロールになります。
   6. 希釈したGII抗体50 μLを2つ目のセットに加えます。この結果、最終抗体濃度はE. cloacaeで1:250、L. gasseriで1:300になります。このサンプルセットは、染色された(AB)サンプルになります。
   7. 希釈したアイソタイプ抗体50 μLを3つ目のセットに加えます。このセットがアイソタイプコントロール(IC)になります。ピペッティングでよく混ぜます。サンプルを氷上および暗闇で30分間インキュベー
   トします。
   8. すべてのサンプルを10,000 x gで5分間遠心分離します。
   9. 上清を捨て、サンプルを100 μLのFCSBに再懸濁します。
   10. すべてのサンプルを10,000 x gで5分間遠心分離し、上清を廃棄し、サンプルを100 μLのFCSBに再懸濁します。
   11. すべてのサンプルを10,000 x gで5分間遠心分離します。
   12. 上清を捨て、サンプルを150 μLのFCSBに再懸濁します。
   13. 各サンプルを400 μLのFCSBバッファーが入ったFCSBチューブに移し、総容量は550 μLです。
   14. サンプルをフローサイトメトリーで分析するまで4°Cに保ちます.
       手記：フローサイトメトリーは、抗体染色後4時間以内に行われます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
5mL ポリストレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付き	コーニング	352235	抗体染色後、サンプルをチューブに移し、フローサイトメトリー解析を行います。
アナロパック	サーモサイエンティフィック	R681001	Lactobacillus gasseriの培養に使用した嫌気性ガスパック
BD FacsDivaソフトウェア
BD LSR Fortessa フローサイトメーター
ウシ血清アルブミン	フィッシャーバイオ試薬	BP1605	フローサイトメトリーに使用
フローサイトメトリー染色バッファー(FCSB)	BDバイオサイエンス	554657	フローサイトメトリーに使用
マウスIgG2bκアイソタイプコントロール(eBMG2b)、PE、eBioscience	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12473281	アイソタイプコントロール。この抗体は、標識型でメーカーから購入しています。
MRSパウダー	BDバイオサイエンス	288130	培地調製およびラクトバチルス・ガッセリの培養に使用されます。
ノロウイルス カプシド G2 モノクローナル抗体 (L34D)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	MA5-18241	ノロウイルスGII抗体。この抗体は非標識型でのみ入手可能であるため、概説されているフローサイトメトリーアッセイで使用する前に蛍光標識する必要があります。このプロトコールでは、PEが選択された蛍光剤でしたが、研究者が使用するフローサイトメーターに最も適した他の蛍光分子を選択することができます。
ノロウイルスGII.4 VLP	創造的なバイオストラクチャー	CBS-V700	ヒトノロウイルス様粒子であるVLPは、バキュロウイルスシステムを使用して生成され、10%グリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁されました。著者たちは、VLPの粒子濃度を決定するために、独立したナノサイト追跡分析を実施した。濃度はミリリットルあたり約1011VLPです。VLPのタンパク質濃度に基づいて、VLP付着アッセイでは細菌あたり約200個の粒子が追加されます。
PBSの10X	フィッシャーバイオ試薬	BP665	使用前に1倍に希釈してください。
SiteClick R-PE 抗体ラベリングキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S10467	非標識抗体の標識に使用される標識キット。
塩化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	S271	培地調製に使用
トリプトン	オキソイド	LP0042	培地調製に使用
チューブリボルバー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	88881001	ウイルス:細菌付着アッセイに使用されます。最高速度(40 rpm)に設定します。
酵母エキス	BDバイオサイエンス	212750	培地調製に使用
寒天	シグマ	A7002	培地調製に使用

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