トランスジェニック線虫におけるマイトファジーを検出するためのIn vivoアッセイ

要約

出典:Fang, E. F., et al. In Vitro and In Vivo Detection of Mitophagy in Human Cells, C. Elegans, and Mice. J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、線虫Caenorhabditis elegansのマイトファジーを研究するためのin vivoアッセイを示しています。線虫をマイトファジー誘導薬に曝露すると、損傷したミトコンドリア上のマイトファジー受容体であるDCT-1とオートファゴソーム膜タンパク質LGG-1との間の共局在によってマイトファジーの発生が評価されます。

プロトコル

>1. C. elegansにおけるマイトファジーの検出

>注:線虫C.エレガンスは、生物レベルでマイトファジーをアッセイするためのプラットフォームを提供します。マイトファジーのモニタリングには、(1)ミトコンドリアを標的とするロゼラ(mtRosella)または(2)GFPと融合したマイトファジー受容体DCT-1と、ディスコソーマspと融合したオートファゴソームマーカーLGG-1の2つの株を使用することができます。赤色蛍光タンパク質(DsRed)。

1. Rosella biosensor
   を用いたマイトファジーモニタリング 注:Rosellaは、pH感受性GFPバリアントに融合したpH非感受性DsRedを組み合わせた分子バイオセンサーです。Rosellaバイオセンサーは、酸性リソソーム(pH~4.5)と他の細胞コンパートメントとの間のpH差を利用します。このバイオセンサーは、出芽酵母や、HeLa、HEK293、HCT116などのいくつかの哺乳類細胞株のマイトファジーを成功裏にモニタリングするために使用されています。この汎用性の高い二重蛍光レポーターを適応させ、ミトコンドリアを標的とするロゼラ(mtRosella)を体壁筋細胞に発現するトランスジェニック線虫を作製しました。マイトファジーの誘導は、mtRosella蛍光のGFP/DsRed比の低下によって示されます。
   1. 1日目:体壁筋細胞にミトコンドリアを標的とするロゼラ(mtRosella)を発現する線虫のL4幼虫を、大腸菌(OP50)を播種した線虫増殖培地(NGM)プレートに解剖顕微鏡で摘み取ります。10〜20匹のワーム/プレートを少なくとも3つの3.5cmプレートに置きます。線虫を標準温度の20°C.
      でインキュベートします。 手記：L4幼虫の識別や、ワームをある場所から別の場所に移動させるために使用されるピックの作り方など、ワームの解剖学については、参考文献を参照してください。
   2. 5日目:15-20匹のL4トランスジェニック幼虫を選択し、それらを新鮮なOP50播種NGMプレートに移すことにより、線虫を同期させます。実験条件ごとに少なくとも5枚のプレートを使用してください。
   3. 7日目:関心のあるマイトファジーに影響を与える薬またはポジティブコントロール用の車両プレートを準備します。
      1. NGMプレートを222μW/cm²(強度)のUV光で15分間露光することにより播種した大腸菌(OP50)細菌を死滅させ、マイトファジー誘導化合物が細菌によって代謝されないようにします。プレートは2,000 J/m².
         で露光する必要があります 注:必要な露光秒数= 2,000 /((μW / cm2の強度)* 100)。
      2. シードしたNGMプレートの上部に目的の化合物を添加します。ネガティブコントロールとして、同量の化合物ビヒクル(ジメチルスルホキシド(DMSO)などの化合物を溶解するために使用される溶剤)を車両プレートに追加します。マイトファジー誘導のポジティブコントロールには、ミトコンドリア毒物であるパラコート(最終濃度8 mM)を使用しました。10 μL の 8 M パラコートストックと 190 μL の ddH₂O を含有する溶液を、処理グループの寒天プレートの上部に加えます。ビヒクルグループについては、10 μL の DMSO と 190 μL の ddH₂O を含有する溶液を寒天プレートの上部に加えます。
         手記：パラコート作業溶液は、4°Cで1ヶ月間保持できます。
      3. 薬物またはビヒクルが表面全体をコーティングするまで、プレートを静かに回転させます。.ワームを移す前に、蓋を室温で少なくとも1時間閉じてプレートを乾かしてください。
         手記： また、液体NGMが固まる前に、液体NGMに薬剤を添加することでも、薬剤プレートを調製することができます。
   4. 7日目:ステップ2.1.2で調製した2日齢の成体トランスジェニック動物の10〜20匹を、パラコート、目的の化合物、またはビヒクル(DMSO)のいずれかを含むプレートに移します。トランスジェニック動物を20°Cで2日間インキュベートします。
   5. 9日目:2%アガロースパッドを準備します。次に、パッドごとにM9中の20 mMレバミゾールの液滴(10 μL)を1つ加えます。トランスジェニック動物をM9-レバミゾール滴中に置くことにより、イメージングのために固定します。上部にカバースリップをそっと置きます。
   6. 落射蛍光顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して、単一のトランスジェニック動物を捕捉します。体壁筋細胞でmtRoselaを発現するトランスジェニック線虫全体の蛍光画像を10倍の倍率で取得します。収集した画像を保存します。
   7. 取得した画像をImageJソフトウェアで処理します。線虫の頭部にある体壁筋細胞を分析して、腸組織での自家蛍光を回避します。各動物の頭部領域のみについて、各蛍光画像の平均ピクセル強度値と総面積を測定します。特定の対象領域を分析するには、次のようにします。
      1. 「画像」と「色」のドロップダウンメニューの下にある「チャンネルの分割」を選択して、画像を変換します。
      2. 「フリーハンド選択」ツールを利用して、関心のある蛍光領域をキャプチャします。
      3. 「分析」ドロップダウンメニューの下にある「測定」コマンドを選択し、ピクセル強度分析を実行します。
      4. ピクセル強度は、強度を分析された総面積で割ることによって正規化する必要があります。正規化時に、GFPとDsRedの比率を計算します。
   8. 統計分析ソフトウェアを使用して、スチューデントのt検定(2つのグループ間の比較)またはANOVA(複数のグループ間の比較)のいずれかを実施し、p < 0.05を有意とする統計分析を行います。
2. DCT-1とLGG-1 注:DCT-1は、ストレス条件に応答してマイトファジー受容体として機能する外ミトコンドリア膜タンパク質であり、哺乳類の推定相同性BNIP3およびNIX / BNIP3Lに似ています。したがって、マイトファジーの開始は、DCT-1マイトファジー受容体とオートファゴソーム膜タンパク質LGG-1(哺乳類LC3の相同体)との間の共局在によって評価されます。
   1. 1日目:DCT-1::GFPとDsRed::LGG-1の両方を体壁筋細胞5に発現するトランスジェニック動物のL4幼虫をOP50播種NGMプレートに選んでください。5〜10本/3.5cmプレートをセットし、少なくとも3枚のプレートを使用します。線虫を20°C.
      でインキュベートします。 手記： 導入遺伝子は別々のプラスミド上に位置し、ゲノムに組み込まれていません。rol-6(su1006)とpmyo-2 GFP変換マーカーの両方を持つ線虫をピックアップします。両方のコントランスフォーメーションマーカーを持つトランスジェニック線虫のみが、体壁筋細胞でDCT-1::GFPとDsRed::LGG-1の両方を発現します。
   2. 1.1.2-1.1.5の手順に従います。
   3. 共焦点顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して、単一の体壁筋細胞をイメージングします。全身壁筋細胞の境界を検出し、63倍の倍率でZスタック画像を撮影します。より高い倍率も使用できます。
   4. 共焦点ソフトウェアで取得した画像を開いて処理します。マイトファジーの開始は、マイトファジー受容体(DCT-1::GFP)がオートファゴソームマーカー(DsRed::LGG-1)に共局在することによって示されます。体壁筋細胞の各スタックにおける共局在イベントを手動で測定します。実験中は、顕微鏡とカメラのすべての設定(レンズと拡大鏡、フィルター、露光時間、解像度、レーザー強度、ゲインなど)を一定に保つことが不可欠です。すべての設定に注意する必要があります。
   5. 統計分析ソフトウェアを使用して、スチューデントのt検定(2つのグループ間の比較)またはANOVA(複数のグループ間の比較)のいずれかを行い、p < 0.05を有意とする統計分析を行います。二元配置比較には、スチューデントのt検定を使用します(p < 0.05は有意であると考えられます)。多重比較では、事後的なBonferroni検定によって補正された単一因子(ANOVA)分散分析を使用します。各実験条件について、少なくとも50〜70匹の動物または30〜50匹の体壁筋細胞を分析することをお勧めします。実験を少なくとも 3 回繰り返します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Eclipse TE-2000e 共焦点顕微鏡	ニコン	#TE-2000E
コローカライゼーションソフトウェア	ボロシティ	#Volocity 6.3	代替Zeiss ZEN 2012ソフトウェア
IN Cell Investigator ソフトウェア	GEヘルスケアライフサイエンス	#28408974
細胞培養液	サーモフィッシャー	#DMEM–ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム
ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	サーモフィッシャー	#15140122
ウシ胎児血清	シグマ・アルドリッチ	#12003C-1000ML
細胞培養インキュベーター	サーモフィッシャー	#Thermo Forma 3110 CO2 ウォータージャケットインキュベーター
落射蛍光顕微鏡	ツァイス		ツァイス アクシオ イメージャー Z2
カメラ	オリンポス		オリンパスDP71
共焦点顕微鏡	ツァイス		ツァイス アクシオ オブザーバー Z1
共焦点ソフトウェア	ツァイス		ZEN 2012
画像解析ソフトウェア	画像J	コローカライゼーション分析など	https://imagej.nih.gov/ij/
統計解析ソフトウェア	GraphPad Software Inc.、サンディエゴ、米国		GraphPad Prismソフトウェアパッケージ
ワームピックを作るための材料	シュアピュアケメタルズ	#4655	ピックは30ゲージ、90%プラチナ、10%イリジウムワイヤーで作られています
IR:N2;例:[pmyo-3 TOMM-20::ロゼラ]	Tavernarakis Nektariosへの資料問い合わせ		トランスジェニック動物を20°Cに維持します
IR:N2;例[pdct-1 DCT-1::GFP; pmyo-3 DsRed::LGG-1]	Tavernarakis Nektariosへの資料問い合わせ
pmyo-3 TOMM-20::ロゼラ	Tavernarakis Nektariosへの資料問い合わせ
pdct-1 DCT-1::GFPの	Tavernarakis Nektariosへの資料問い合わせ
pmyo-3 DsRed::LGG-1	Tavernarakis Nektariosへの資料問い合わせ
パラコートソリューション
M9 バッファー
M9-レバミゾールバッファー
ガラス顕微鏡スライドとカバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック	#B9992000
外科用鉗子	STERISアニマルヘルス	19ピース犬用避妊去勢手術パックエコノミー
手術用ハサミ	STERISアニマルヘルス	19ピース犬用避妊去勢手術パックエコノミー
1x PBSの	サーモフィッシャー	#AM9625	10x PBSは、ddH2Oを使用して1x PBSに希釈する必要があります
シェーカー	フィッシャーサイエンティフィック	#11-676-178	Thermo Scientific MaxQ HP 卓上軌道小型オープンエアプラットフォームシェーカーパッケージ A
2%アガロースパッド
バイブロスライスブレード	世界の精密機器	#BLADES-2	シングルエッジブレード
金属プレート	MSCの	#78803988	厚さ0.012インチ×幅6インチ×長さ12インチ、430ステンレス鋼板
トリトンX-100			洗剤
メチルビオロゲン二塩化物水和物	シグマ・アルドリッチ	#856177	パラコート
線虫用インキュベーター	アクアリティック		20°Cを維持するインキュベーター
実体顕微鏡の解剖	オリンポス	SMZ645
共焦点顕微鏡	ツァイス	アクシオオブザーバーZ1	線虫の場合(ステップ2)
落射蛍光顕微鏡	ツァイス	アクシオイメージャーZ2	線虫の場合(ステップ2)
UVクロスリンカー	ビルバー・ルールマット	バイオリンク – BLX-E365	UV光源; 356 nm

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