タンパク質バイオマーカー検出のためのキャピラリー電気泳動イムノアッセイ

要約

出典:Sage, J. M., et al. キャピラリー電気泳動イムノアッセイを使用して、ヒト血小板における筋萎縮性側索硬化症の潜在的なバイオマーカーを検索します。J. Vis. Exp.(2020年)

このビデオは、ヒトの血小板から筋萎縮性側索硬化症(ALS)に関連するタンパク質バイオマーカーを検出するための毛細血管電気泳動イムノアッセイプロトコルを示しています。ALSバイオマーカータンパク質の存在の確認は、血小板タンパク質のサイズベースの分離とそれに続く化学発光検出によって達成されます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. バッファーと試薬の調製

>注:すべてのサンプルは、製造元のガイドラインに従って準備してください。この手順では、個人用保護具(白衣、手袋、ゴーグル)を着用してください。

1. 0.941gのスクロース(最終濃度11mM)、6.4mLの5M塩化ナトリウム(NaCl、128mM最終)、5.4mLの0.2Mリン酸一ナトリウム(NaH₂PO₄、4.3mM最終)、9.4mLの0.2Mリン酸二ナトリウム(Na₂HPO₄、7.5mM最終)、0.352gのクエン酸ナトリウム(4.8mM最終)を組み合わせてクエン酸洗浄緩衝液を調製します。 0.115 gのクエン酸(最終2.4 mM)。ddH₂Oで総容量を250 mLに調整し、0.45 μmのフィルターディスクでろ過し、pHを6.5に調整します。4°Cで最大1年間保存し、溶液を室温(RT)に戻してから使用してください。
2. 250 mMのスクロース、1 mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、および10 mMのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩(Tris-Cl、pH 7.4)を最終容量100 mLに組み合わせて、ラプチャーバッファーを調製します。4°Cで最大1年間保存し、2 μLのホスファターゼ阻害剤カクテル(1:1000最終)と1 μLのプロテアーゼ阻害剤カクテル(1:2000最終)を2 mLのラプチャーバッファーに加えます。使用するまで氷の上に置いてください。未使用のラプチャーバッファーを破棄します。

2. 血小板の単離

1. 酸-クエン酸-デキストロース(ACD)溶液(75 mMクエン酸三ナトリウム、124 mMデキストロース、および38 mMクエン酸、pH = 7.4)を含むイエローキャップ採血チューブに8〜10 mLのヒト血液を採取します。ACD:血液= 1:9)。チューブの内容物を手で5〜6倍反転させて穏やかに混ぜます。
2. チューブをスイングバケットローターで200 x gでRTで20分間遠心分離します。
3. 多血小板血漿(PRP)(~3〜4 mL)を15 mLの円錐形ボトムチューブに集め、汚染を避けるためにバフィーコート(かすんだように見える画分)から約0.5 mLのPRPを残します。赤血球の汚染が発生した場合は、この手順を繰り返します。
4. PRPサンプルを1,200 x gでRTで15分間遠心分離します。
5. 血小板ペレット(P1)をクエン酸洗浄バッファー1 mLで穏やかに再懸濁して洗浄し、ペレットを1,200 x gで室温で15分間遠心分離して
洗浄します。
6. 純粋な血小板ペレットを保存します。上清を捨てます。
7. 血小板ペレットを阻害剤カクテルを含むラプチャーバッファー600μLに再懸濁します。
8. 超音波処理器を使用して血小板懸濁液を超音波処理します。サンプルをミニアイスバケツに入れます。ソニケーターを設定3で連続モードで20秒間設定します.
   注意: 10%漂白剤でプローブを洗浄し、続いて蒸留水で洗浄します。
9. 超音波処理したサンプルを20,000 x gで4°Cで30分間遠心分離し、膜状画分を除去します。上清を60μLで分注し、-80°Cで保存します。血小板の細胞質画分の解凍/凍結サイクルを繰り返さないでください。

>3. キャピラリー電気泳動イムノアッセイ(CEI)の準備

>注:ALS患者(n = 8–10)から100μLのヒト血小板溶解物を組み合わせ、健康な被験者(n = 8–10)を別々にプールしてアッセイの最適化に使用しました。

1. CEIレイアウト(表1)およびサンプル調製(表2)用に社内で生成されたテンプレートに記入します。サンプル混合物調製テーブルは動的で、ソースから除去する必要がある量を自動的に計算します.
   注:必要なソース容量を動的表2に入力すると、0.1 Xサンプルバッファ容量が自動的に計算されます。
2. 25本の0.2 mL PCRチューブをキャピラリー#1〜#25で事前に標識し、PCRラックに入れます。氷の上に置きます。
3. 0.6 mLマイクロ遠心チューブの事前標識:使用する一次抗体と希釈液(必要な場合)ごとに1本、0.1倍サンプルバッファーに1本、ルミノール-S/過酸化物に1本、希釈するサンプルごとに1本(必要な場合)に1本。チューブラックの氷の上に置きます。
4. サンプルバッファー、洗浄バッファー、プレート 1 枚、および CEI 分離 12–230 kDa マスターキット分離モジュールに付属のカートリッジを取り出します。
5. 4°Cの冷蔵庫から、抗体希釈バッファー、一次抗体、二次抗体、ルミノール、過酸化水素、スタンダードパックを取り出します。標準パックを除くすべての試薬を氷上に置きます。標準パックはRT.
   に留まります 注:標準パックの試薬は凍結乾燥され、ホイルカバーで密封されています。製品の損失を減らすために、これらは開く前にミニ遠心分離機を使用して短時間回転させる必要があります。試薬チューブを開くには、ピペットの先端で穴を開けるか、角から引き戻します。
6. 400 mMジチオスレイトール(DTT)を調製するには、DTTを含む透明なチューブに40 μLの脱イオン水を加えます。
7. 40 μLの蛍光5倍マスターミックスを調製するには、キットに付属のピンク色のチューブに、20 μLの10xサンプルバッファーと20 μLの調製した400 mM DTT溶液を加えます。
8. ビオチン化ラダーを調製するには、キットに付属の白色チューブに、脱イオン水16 μL、10xサンプルバッファー2 μL、調製した400 mM DTT溶液2 μLを加えます。穏やかに混合し、0.2 mLのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブに移して変性させます。
9. 0.6 mLの微量遠心チューブに1.5 μLの10xサンプルバッファーと148.5 μLの脱イオン水を加えて、0.1xサンプルバッファーを調製します。渦を巻き起こして混ぜ合わせ、氷の上に置きます。
10. 目的の抗体希釈液を調製します。抗体希釈液を指定容量で各標識済みマイクロ遠心チューブに添加します。容量が同一の場合は、リバースピペッティング技術を使用します。そうでない場合は、分注する前にピペットチップを事前にすすいでください.
    注:このアッセイでは、A-TDP-43 pan抗体とa-p(S409/410-2) TDP-43抗体を使用しました。抗ERK抗体は、アッセイ成分が機能していることを確認するための内部制御に使用されました。
11. 抗体希釈のためのリバースピペッティングは、以下に説明するように行ってください。あるいは、参考文献に追加情報があります.
    注:リバースピペッティングは、少量の連続した溶液を分注する場合に適しています。この手法には、(i)正確な容量を提供できる、(ii)先端オリフィスで試薬が泡立つのをなくす、(iii)少量(<5 μL)の試薬、粘性溶液、界面活性剤溶液、および高蒸気圧の溶液に最適であるという利点があります。
    1. 適切なチップをピペットに入れ、プランジャーを2番目のストップまで押し下げます(ステップ2)。ピペットチップを溶液に数ミリメートル浸します。プランジャーをゆっくりと放して、チップがまだ浸されている間にピペットチップに溶液を充填します。チップを溶液から取り出し、試薬リザーバーの端にそっと触れて、チップの外側に残っている余分な液体が取り除かれます。
    2. プランジャーを最初のストップまで押して溶液を分注します(ステップ1)。チップに残っている溶液を分注しないでください。
    3. チップに残っている溶液を試薬リザーバーに空にするには、プランジャーを2番目のストップまで押します(ステップ2)。プランジャーを次のピペッティングステップの準備位置に離します。
    4. 必要な抗体を指定された容量で、あらかじめ標識した各微量遠心チューブに添加します(表1)。ピペットチップを事前にすすぐのではなく、希釈液に直接加え、チップを複数回洗い流して抗体を除去します。チューブを氷の上に置きます。
12. CEIサンプルミックスを調製するには、cap#2からcap#25のラベルが付いたPCRチューブに対して以下の手順を実行します:これは表1と同じ順序です。
    1. すべてのチューブを開き、リバースピペッティング技術を使用して各チューブに蛍光5xサンプルバッファーの1.6μLアリコートを加え、5xバッファーを添加したら各PCRチューブを閉じてサンプル損失を最小限に抑えます。
    2. すべてのチューブを開き、表2で指定した容量の0.1倍のサンプルバッファーを各チューブに追加し、直後に閉じます。容量が同一の場合は、リバースピペッティング技術を使用します。そうでない場合は、0.1xサンプルバッファーを分注する前にピペットチップを事前にすすいでください。
    3. すべてのチューブを開き、表2で指定された量のタンパク質サンプルを各チューブに加え、直後に閉じます。容量が同一の場合は、リバースピペッティング技術を使用します。そうでない場合は、0.1xサンプルバッファーを分注する前にピペットチップを事前にすすいでください。
    4. ベンチトップ遠心分離機(13,000 x g、30秒)ですべてのPCRチューブを短時間遠心分離し、PCRチューブをフリック/ボルテックスして混合し、遠心分離を繰り返します。
    5. すべてのPCRチューブを、加熱された蓋付きのサーモサイクラーに移します。定義された温度と持続時間(例:95°Cで5分間、70°Cで10分間)でサンプルを変性させます。
       注:変性温度と変性時間は、標的タンパク質に対して最適化する必要があります。
    6. 手順3.12.4を繰り返します。
    7. すべてのPCRチューブをチューブラックに戻し、氷の上に置きます。
    8. 変性ステップでは、現像液(1:1 luminol-S:過酸化物溶液)を調製し、200 μLのルミノール-Sと200 μLの過酸化物を添加します。氷の上に置きます。
    9. 上記で調製したサンプルをCEIプレフィルドプレートにロードするには、アッセイレイアウトに示されているアッセイプレートに試薬とサンプルを分注します(図1)。気泡の持ち込みを避けてください。
       注:容量と溶液が同一の場合は、リバースピペッティング技術を使用してください。そうでない場合は、分注する前にピペットチップを事前にすすぎ、ピペットの2番目のタブストップを使用して残りをプレートウェルに排出しないでください。12〜230 kDaの分離モジュールには、色分けされたプレートローディングガイドが含まれている場合があります。このガイドは、試薬やサンプルをウェルに加える際にプレートの下に置くと、サンプルのロード時に視覚的に役立ちます。プレートローディングガイドは、同社のWebサイトからもダウンロードできます。
       1. 15 μL のルミノール: 過酸化物ミックスを E 列の各ウェルに加えます。
          注:理想的には、この試薬は使用直前に調製し、各ウェルに加えます。これが不便な場合は、この混合物をプレートローディングの30分以内に調製できます。
       2. 行DのウェルD1に、10 μLのストレプトアビジン-HRPを添加します。
       3. D列DのウェルD2–D25に、指定の二次抗体10 μLを加えます。
       4. B列に、各ウェルに10 μLの抗体希釈液を加えます。
       5. C列にウェルC1に10 μLの抗体希釈液を加えます。
       6. C列のウェルC2–C25に、指定の一次抗体10 μLを添加します。
       7. 列AのウェルA1に、PCRチューブ#1から5 μLのビオチン化ラダーを加えます。
       8. 行AのウェルA2–A25に、3 μLのサンプル、PCRチューブ#2–#25を対応するウェル#2–#25に加えます。
       9. 500 μLの洗浄バッファーを、指定された各洗浄バッファーウェルに添加します。
       10. プレートを1,000 x gで5分間、室温で遠心分離します。

>表1:CEIアッセイプレートローディングテンプレート。

>表2:インタラクティブなサンプル混合物調製テンプレート。未知のサンプルからストックタンパク質濃度を入力すると、インタラクティブセルは、サンプルミックスの調製に使用する必要のある量を自動的に計算します。

結果

図1:アッセイのレイアウト。一次抗体と標的タンパク質の両方のサンプルの最適化を1つのアッセイで実行できます。キャピラリー2-7、8-13、14-19、および20-24は、さまざまなタンパク質濃度と一次抗体の範囲を表しています。キャピラリー25はポジティブコントロールを表す。抗ERK抗体を使用しました。ただし、適切なポジティブコントロールを含めることができます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
12-230 kDa分離キット	プロテインシンプル	SM-W004	充填済みのアッセイプレートと25チャンネルキャピラリーカートリッジが含まれています
3000Gサーモサイクラー	テクネ	FTC3G/02	このサーモサイザーをサンプルミックスの加熱に使用しました
マウス対策検出キット	プロテインシンプル	042-205	HRP標識二次抗体、バッファー、ルミノール試薬、分子量マーカーを含む
抗P(S409-410) TDP-43抗体	プロテインテック	22309-1-AP	リン酸化TDP-43を認識する一次抗体
抗P(S409-412) TDP-43抗体	コスモバイオUSA	先端-PTD-P02	リン酸化TDP-43を認識する一次抗体
ウサギ防止検出キット	プロテインシンプル	DM-001	HRP標識二次抗体、バッファー、ルミノール試薬、分子量マーカーを含む
抗TDP-43(pan)抗体	プロテインテック	10782-2-AP	TDP-43タンパク質全体を認識する一次抗体
ソニック・ディメンブレーター;モデル100	フィッシャーサイエンティフィック		ソニケーター。細胞膜を破裂させるために使用されます。このモデルは販売終了しました(モデルXL2000-350)
テーブルトップ遠心分離機	エッペンドルフ	22625004	モデル#5810スイングプレートバケット付き
ウェスアナライザー	プロテインシンプル	55892-WS-2203	キャピラリーゲル電気泳動を行います
SimpleWestern(SW)用コンパス	プロテインシンプル	Ver.4.0.0です。	Compass for SWは、SimpleWestern機器用の制御およびデータ解析アプリケーションです