マイクロ流体デバイスを用いた磁性ナノ粒子を用いたイムノアッセイ

要約

出典:Hernández-Ortiz, J. A., et al. Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays. J. Vis. Exp.(2022年)。

このビデオは、磁性ナノ粒子ベースの免疫測定法のためのマイクロ流体システムを示しています。検出システムは、チャネル内に磁気トラップを組み込んだマイクロ流体デバイスを利用しています。一次抗体およびペルオキシダーゼ標識二次抗体に結合した抗原被覆磁性ナノ粒子からなる、あらかじめ形成された免疫複合体をチャネルに導入します。免疫複合体は、外部磁場を印加すると多孔質磁気トラップに捕捉されます。ペルオキシダーゼによる触媒作用により蛍光を発する蛍光性基質を用いて、捕捉された免疫複合体を顕微鏡で検出します。

プロトコル

1. デバイスの準備

1. シリンジを使用してチャネルに蒸留水を入れます。漏れや流れの抵抗がないことを確認してください。デバイスを超音波浴に10分間浸して、チャネル内に残っているアクリル、接着剤、または不要な材料をすべて取り除きます。
2. デバイスチャネル内の水を空にします。シリンジを使用して、1x Tris緩衝生理食塩水(TBS)で希釈した5%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)で調製し、0.2 μmポリエーテルスルホン(PES)シリンジフィルターでろ過したブロッキング溶液を導入します。
3. 直径7.5μmの鉄微粒子を5%BSA.
   中に懸濁液を調製します 手記： この微粒子は、タンパク質の吸収に対する耐性を付与するシリカ-ポリエチレングリコール(PEG)層であらかじめ官能基化されています。
4. チップと微粒子懸濁液をブロッキング溶液と室温で少なくとも1時間インキュベートします。可能であれば、4°Cで一晩ブロッキングします。

>2. 微粒子トラップの形成

1. シリンジ針でサイドチャネル出口ホースを通じて微粒子をチップに挿入します。チップを垂直に置き、重力の影響下で微粒子がサイドチャネルを通って流れるようにします。チップを90°の2ステップで180°回転させ、マイクロ粒子が5μmの制限でターゲットを絞って圧縮できるようにします。
2. 重力でサイドチャネルに向かって45°回転させることにより、余分な微粒子を除去します。
3. 微粒子トラップが外れないように、デバイスを直立させてください。マイクロ粒子トラップ形成プロセスの概要については、図1Bを参照してください。

3. イムノアッセイ

1. ナノ粒子の調製
   1. リゾチーム(抗原モデル)と結合した100 nmナノ粒子の懸濁液を2 μL取ります。100 μLのブロッキング溶液を入れた1.5 mLの微量遠心チューブに加えます。4°Cで一晩インキュベートします。
   2. 150 μLの洗浄バッファー(1x TBS、0.05% Tween 20)を加えます。
   3. 1.5 mLの微量遠心チューブを磁気セパレーターに入れます。ナノ粒子を分離するために15分間保持します(図2).
      手記： マグネティックセパレーターの最小容量は200μLですので、これより小さい容量の使用は避けてください。
   4. マイクロピペットでチューブから液体を取り出します。ナノ粒子ペレットが形成されたチューブの壁との接触を避けてください。
   5. 250 μLのフレッシュウォッシュバッファーを加えます。チューブを15分間攪拌し続けます。
   6. 手順3.1.3.-3.1.5を2回繰り返し、5分間だけ振とうします。
   7. 必要な濃度の一次抗リゾチーム抗体を添加します(材料表を参照)。抗体希釈液 (1x TBS、1% BSA、0.05% Tween 20) の最終容量を 100 μL に調整します。
   8. 37°Cで15分間インキュベートし、室温でさらに15分間振とうし続けます。
   9. 洗浄手順3.1.2.-3.1.6を繰り返します。
   10. 抗体希釈液100μLを添加します。西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体(HRP-AbII)(材料表を参照)を1:500の希釈で添加します。
   11. 洗浄手順3.1.2.-3.1.6を繰り返します。
   12. ナノ粒子を最終容量の50 μLの抗体希釈液に保持します。

4. 実験的な実装

1. 2つの100 μLガラスシリンジに水を入れ、各シリンジに長さ6.5 cmのホースを接続し、ホースの端に金属ピンを挿入し、両方のシリンジをコンピューター制御のシリンジポンプに置きます。
2. アクリルデバイスのすべてのホースを熱で密封します。
3. インレットホースをカットし、数ミリメートルだけに保ちます。ディスペンシングニードルにウォッシュバッファーを充填し、カットホースに挿入します。針をデバイスに接続する前に溶液を滴下させて、デバイスへの空気の侵入を防ぎます。
4. アウトレットホースを横方向のチャネルから切り取ります。シリンジポンプに接続します。次に、メインチャネルの出口ホースについても同じ手順を実行します.
   手記：手順4.3から4.4を実行することが重要です。この順序で、微粒子トラップの開梱を避けるためです。可能であれば、虫眼鏡を使用して、これらの手順でトラップの状態を確認します。
5. 顕微鏡ステージにスライドガラスを置きます。磁石を両面テープでスライドに取り付け、両側に小さなテープを貼ってチップの端をガラスに固定します。
6. シリンジポンプコントローラーの[Flow Rate]タブと[Units]タブで、流量を50 μL/hに設定します。引き出しモードを選択し、開始ボタンをクリックして、洗浄バッファーの流れをアクティブにします。
7. 慎重に、トラップを含むチップの領域が磁石に接触するように、磁石を使用してスライドに向かってデバイスを水平に近づけます。
8. デバイスの端を両面テープでガラスに貼り付けて、動きを防ぎます。顕微鏡検査の光路を遮らないようにしてください(図1C)。

>5. 免疫検出

1. 洗浄バッファーを50 μL/hで10分間流し続け、過剰なBSAを除去します。
2. マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り出します。.ナノ粒子懸濁液50μLを添加します。
3. ナノ粒子の懸濁液を100μL / hの流速で7分間流します。その後、流速を50 μL/hに変更し、さらに15分間流します。
4. ディスペンシングニードルを交換してください。洗浄バッファーを50 μL/hで10分間流します。洗浄ステップ中に、メーカーの仕様に従って蛍光基質を準備します。
5. マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り出します。.蛍光基質100μLを加えます(材料表を参照)。蛍光基質を50 μL/hで6分間流します。
6. シリンジポンプを制御するインターフェースの対応する[Flow Rate]タブと[Set Timer]タブで、流量(1 μL/h、3 μL/h、5 μL/h、および10 μL/h)と時間(6 min)の測定パラメータを設定します。実行する各測定について、必ず引き出しモードを選択してください。
7. 追加の流量タブを50 μL/hに設定し、洗浄ステップのタイマーを3分に設定します。
8. 50 μL/hの基質が停止する15秒前に顕微鏡の蛍光をオンにします。1,000ミリ秒の露光時間で基板が停止する10秒前に、顕微鏡カメラのソフトウェアで画像キャプチャを開始します。1フレーム/秒(FPS)で6分間のイメージングを行います。
9. 50 μL/hでの基質洗浄流量が停止した直後に、目的の流量パラメータの[開始]ボタンをクリックします。選択した測定フローが停止した直後に、洗浄フロー(50 μL/h)の[開始]ボタンをクリックします。
10. 画像キャプチャを停止し、顕微鏡の蛍光をオフにして、基板の光退色を防ぎます。
11. 使用する測定流量ごとに、手順5.8.〜5.10を繰り返します。

結果

図1:最終的なデバイス設定。(A)対応する入力と出力にホースが取り付けられたアクリルデバイス。スケールは、デバイスの寸法をセンチメートル単位で示しています。(B)微粒子トラップの形成のためのプロトコル。マイクロ粒子は、デバイスが垂直位置に配置されると、重力によってチャネルを流れます。微粒子は5μmの制限で濃縮されます。余分な微粒子は、サイドチャネルを介してチップを回転させることで簡単に除去できます。チップは、イムノアッセイの前にトラップを保存するために垂直に保たれます。(C)倒立蛍光顕微鏡のステージ上に、磁石が入ったスライドガラスに取り付けたマイクロ流体デバイス。試薬が添加される分注針と、シリンジポンプに接続する出口ホースが観察されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カルボニル鉄微粒子	シグマ・アルドリッチ	44890	7μm
クロロホルム	フェルモント	6201	健康被害: 中等度 可燃性:なし 反応性:なし 接触の危険性:中程度
CMOSカメラモーメント	Teledyne Photometrics (テレダイン・フォトメトリクス)		センサー技術:CMOS 量子効率:73% ピクセルサイズ:4.5μm x 4.5μm 対応インターフェース:USB 3.2 Gen 2
Dr Engraveソフトウェア	ローランド ディー・エー株式会社		表面の彫刻パスを設計および作成するための彫刻ソフトウェア
抽出フード	不明	不明
フレキシブルプラスチックチューブ	タイゴン	AAD04103	ID = 0.020、OD = 0.060
蛍光マイクロソープ	ツァイス	アクシオ Vert.A1
高精度ディスペンスニードル	ロックタイト	98612
MagJETセパレーションラック	サーモサイエンティフィック		12 x 1.5 mL
ポリメチルメタクリレート - シート - PMMA、アクリル	グッドフェロー	ME303018月1	厚さ:1.3mm、透明度:クリア/透明
PVCamTestソフトウェア	Teledyne Photometrics (テレダイン・フォトメトリクス)	バージョン 3.10.107	画像取り込みソフトウェア
実体顕微鏡	ニコン	SMZの7457
SuperMag カルボキシルビーズ	オーシャンナノテック	KSC0100	100ナノメートル
シリンジポンプ	kdサイエンティフィック	KDS200	シリンジを2本まで収納可能
ウトラソニックバス	ブランソン	2800
VPanelソフトウェア	Windows OSの	バージョン 1.0.3.0	マイクロミリングマシンを制御するためのソフトウェア