がん細胞における複製ストレスを定量するための免疫蛍光法

Abstract

出典:Ramakrishnan, N. et al., Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence.J. Vis. Exp. (2023年)

このビデオは、がん細胞の複製ストレスを定量化するための免疫蛍光ベースのアプローチを示しています。ヒドロキシ尿素処理細胞は、免疫蛍光法によって検出される一本鎖DNAを産生します。緑色の蛍光病巣の数は、がん細胞における複製ストレスのレベルを示しています。

Protocol

>注:これらのステップでは、卵巣がん細胞株OVCAR3を使用しましたが、このプロトコルは、非卵巣源に由来する細胞株を含む、他の複数の細胞株に広く適用できます。プロトコルの概略図を図1に示します。

1. セルのメッキ

1. ポリ-L-リジンコーティングされたカバースリップを作成します。
   1. オートクレーブ処理した直径12 mmのカバーガラスをポリ-L-リジン溶液を入れた50 mLコニカルチューブに加え、ロッカーに15分間置きます。
   2. 組織培養フードで溶液を吸引します。滅菌水を加えてカバースリップを洗い、カバースリップの入ったチューブをロッカーに5分間戻します。この洗浄手順を3回繰り返します。
   3. コーティングされたカバースリップを滅菌皿に広げ、残っている水を吸引します。.カバースリップを組織培養フード内で1時間、または水滴がなくなるまで乾かします。乾いたら、皿をパラフィルムで密封し、4°Cに置きます。
2. ポリ-L-リジンコーティングされたカバースリップを1枚、24ウェルプレートの各ウェルに入れます。ポリリジンカバースリップの使用は、抽出前のステップ中にカバースリップから細胞が剥離するのを防ぐために重要です。
3. OVCAR3細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したら、OVCAR3細胞をトリプシン化します。
   1. 70%〜80%がコンフルエントな10cmの培養皿をトリプシン化するには、プレートから培地を吸引し、5〜7mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄します。
   2. PBSを吸引し、0.25%トリプシン1mLを加え、皿を37°Cのインキュベーターに8〜10分間、または細胞がプレートの底から浮き上がるまで
   置きます。
   3. 細胞を5〜10mLの培地で収集し、円錐形のチューブに加えます。
   4. 標準的な手順を使用して、血球計算盤で細胞を手動でカウントします。
4. 25,000細胞/mLの希釈を行い、24ウェルプレートのウェルに置いたポリ-L-リジンカバースリップに1 mLの細胞を加えます。他の細胞株については、3回の集団倍加後に細胞が約70%〜80%コンフルエントになるような数を決定します。
5. 標準条件下で培地中の細胞を増殖させます。

2. IdUで細胞をパルスする

1. 細胞がカバーガラスに適切に広がるためには、1つの集団が倍増するだけで十分です。1つの集団倍増の後、10 μM 5-iodo-2'-deoxyuridine(IdU)を細胞にパルスします(IdUの再構成方法に関する資料表を参照)
   手記：ブロモデオキシウリジン(BrdU)、5-クロロ-2′-デオキシウリジン(CIdU)、IdUなど、さまざまなチミジン類似体を試しました。3つのアナログの中で、IdUは最高の信号対雑音比を提供します。3つの異なるアナログでパルス化された細胞の比較画像を図2に示します。(i)IdUパルスサンプルなし、および(ii)一次抗体なしコントロールの2つのネガティブコントロールの使用を推奨します。特定の治療によりssDNAの形成を評価する必要がある場合は、最初のIdU倍増後に薬剤を追加することをお勧めします。
2. IdUで2回の集団倍増を行った後、イメージングのために細胞を回収します。
   1. 培地を氷冷した0.5% PBSTx(PBS + 0.5% Triton X-100)と氷上で5分間交換します。この抽出前ステップにより、クロマチン結合タンパク質はそのまま残されたまま、細胞質および非クロマチン結合タンパク質を放出することができます。特定の細胞株は、抽出前に容易に剥がれ落ちることがあります。このようなシナリオでは、0.5% CSKバッファー(10 mM PIPES(pH 6.8)、100 mM塩化ナトリウム(NaCl)、300 mMスクロース、3 mM塩化マグネシウム(MgCl₂)、1 mMエチレングリコール四酢酸(EGTA)、0.5% Triton X-100)を使用することができます。

3. 固定

1. PBSTxを吸引し、室温で3%パラホルムアルデヒド(PFA)(Table of Materials)と15分間インキュベートした後、1x PBSで3〜4回洗浄します。固定セルは、次のステップまで4°Cに保つことができます。
   注意:PFAは非常に毒性が高く、発がん性があります。皮膚、目、粘膜との接触を避けてください。ドラフト内でPFAを使用してすべての手順を実行し、材料を適切に廃棄します。

4. 透過化とブロッキング

1. 固定後、0.5% PBSTxを氷上で5分間使用して細胞を透過処理し、カバーガラス全体(通常は500μLから1mL)を覆うのに十分な容量を使用します。
2. 0.2% PBST(1X PBS + 0.2% Tween-20)で細胞を室温で3〜4回洗浄します。各ウェルの洗浄には、1mLのPBSTで十分です。インキュベーションなしで連続して洗浄を行います。
3. PBSTを吸引し、5%ウシ血清アルブミン、1x PBS(ブロッキングバッファー)で作製したBSA(Table of Materials)を使用して、室温で30分間サンプルをブロッキングします。

>5. IdU抗体による免疫染色

1. 免疫染色には、加湿チャンバー(平底のタッパーウェアに濡れたペーパータオル)を調製します。24ウェルプレートの蓋をパラフィルムで覆い、加湿チャンバーに入れ、プレートの蓋にカバースリップを置きます。
2. 抗BrdU一次マウス抗体(Table of Materials)を、ステップ4.2のブロッキングバッファーで1:200に希釈して調製します。抗BrdU抗体は、以前にIdUを検出することが示されています。
3. カバーガラスの上部に希釈したIdU抗体60 μLを加えます。カバーガラスを37°Cで1時間インキュベートします。
   1. あるいは、パラフィルム上にピペットで移した1:200抗体希釈液の滴下(20-25 μL)にカバースリップをひっくり返す場合は、抗体溶液の使用量を減らしてください。これにより、インキュベーション中に溶液が乾燥する可能性も減少します。
4. 1時間のインキュベーション後、一次抗体を吸引します。カバーガラスを24ウェルプレートに戻し、0.2% PBSTで4回洗浄します。
5. 二次抗体については、ステップ5.1で説明したものと同じ加湿チャンバーを使用します。抗マウス標識二次抗体(Table of Materials)をブロッキングバッファー(1:200)で希釈します。カバーガラスに60 μLの二次抗体を添加し、室温で暗所で1時間インキュベー
トします。
6. 二次抗体を吸引します。カバースリップを24ウェルプレートに戻し、0.2% PBSTで4回洗浄します。
7. 顕微鏡スライドにラベルを付け、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)封入剤(材料表)でカバースリップをスライドに取り付けます。スライドは暗所で室温24時間保管してください。24時間のインキュベーションは、封入剤を硬化または硬化させる必要がある場合に推奨されます。
   手記：その後、スライドは4°Cで保存してから、蛍光顕微鏡でイメージングできます。代表的な画像を図3に示します。

Results

図1:IdUラベリングの概略図。細胞にIdUをパルス化して、2回の集団倍増を行います。薬物治療が必要な場合は、IdUの存在下で最初の集団が倍増した後に投与する必要があります。

図2:IdU、BrdU、またはCldUでパルスした後に得られる病巣信号の比較。3つの異なるチミジン類似体をパルス化した細胞の代表的な画像。DAPI、GFP(Alexa-488でラベル付けされたIdUの病巣を表す)、およびマージされたチャンネルが表示されます。スケールバー:10μm。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3%パラホルムアルデヒド(PFA)	フィッシャーサイエンティフィック	NC0179595	スクロース 10 g + 100 mL 10X PBS + 水で容量を 925 mL にします。40% メタノールフリー PFA 75 mL を加えて混合し、50 mL の分量を調製してから保存 保管:-20°Cで保管
5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)	シグマ・アルドリッチ	I7125-5Gの	MW=354.10g/mol。10 mM ストックの場合: 3.541 mg IdU を 1 mL 1 N 液体アンモニアに溶解
抗BrdU抗体	BDバイオサイエンス	347580	保存方法:4°Cで保存
抗マウスAlexa Fluor Plus 488二次抗体	サーモサイエンティフィック	A32766の	光に敏感 - 暗闇に保管してください
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	A7906-100G	PBS の体積に比質量を加算して作られます 保存方法:4°Cで保存
円形カバーガラス	電子顕微鏡科学	72230から01
OVCAR3	ATCCの	HTB-161	増殖培地:RPMIにL-グルタミン、0.01 mg/mLウシインスリンを補充、最終濃度20%のウシ胎児血清および1X Pen Strep 保存:凍結培地:成長培地+ 5%DMSOおよび-80°Cで保存
ポリ-L-リジン溶液	シグマ・アルドリッチ	4832-50ミリリットル	保存方法:4°Cで保存
ProLong Diamond 退色防止封入剤 DAPI付き	サーモサイエンティフィック	P36962	保存方法:4°Cで保存
トリプシン-EDTA、0.25%	ジェネシー・サイエンティフィック	25〜510	保存方法:4°Cで保存
水、滅菌ろ過	シグマ・アルドリッチ	幅3500-6×500ML	保存方法:4°Cで保存