交差反応性のない多重化サンドイッチ免疫測定法のためのスナップチップ技術

要約

出典:Li, H. et al., Snap Chip for Cross-reactive-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays.J. Vis. Exp. (2017年度)

このビデオでは、交差反応性のないマルチプレックスサンドイッチ免疫測定法のためのスナップチップ技術の実装を紹介しています。それぞれ異なる試薬を含む2つのマイクロアレイスライドをスナップする簡単な操作で、クロスコンタミネーションなしで試薬の移動が保証され、サンドイッチイムノアッセイを使用して複数のタンパク質を検出するのに役立ちます。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. スナップチップの製作と保管

1. シングルトランスファー方式(図1a)
   1. 400 μg/mL 抗体と 20% グリセロールをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に含有する cAb 溶液を、相対湿度 60% (各スポットあたり 1.2 nL)、中心間間隔 800 μm のニトロセルロース (または官能基ガラス) アッセイスライド上にスポットします。スライドが一方の角に従ってスポッターデッキに固定されていることを確認してください(ここでは、左下隅が使用されました)。
   2. Spotted Assayスライドを室温で1時間、相対湿度60%でインキュベー
   トします。
   3. アッセイスライド上に16個のコンパートメントを備えたスライドモジュールガスケットをクランプして、16個のウェルに分割します。0.1% Tween-20(PBST)を含むPBSを80 μLを各ウェルに加え、シェーカーで450 rpmで5分間振とうして、スライドを3回すすぎます。
   4. 各ウェルに80 μLのブロッキング溶液を加え、450 rpmで1時間振とうします。
   5. ガスケットを取り外し、アッセイスライドを窒素の流れで乾燥させます。
   6. トランスファースライドをスポッターデッキに固定し、スライドの左下隅をスポッターデッキの左下隅に押し付けます。インクジェットは、捕捉抗体(cAbs)と同じレイアウトで一連のアライメントマーク(ポリスチレンマイクロビーズの溶液)を見つけます。
   7. アライメントマークを乾かします。トランスファースライドを裏返してスポッターデッキに戻し、左下隅に固定します。
   8. 20 μg/mL 抗体、20% グリセロール、および 1% ウシ血清アルブミン(BSA)を含む検出抗体(dAb)スポッティング溶液を調製します。
   9. スポッターのカメラを使用して、位置合わせマークの写真を撮ります。この画像を基準としてスポッティングプログラムに実装し、インクジェットスポッターの画像認識システムに左上のマークを識別させます。その座標を dAb 配列の最初のスポットとして使用します。液滴あたり8nLをスポットし、中心間間隔は800μmです。
2. ダブルトランスファー方式(図1b)
   1. インクジェットスポッターデッキの左下隅に転写スライド1を置きます。400 μg/mL 抗体、20% グリセロール、および 1% BSA 含有 PBS を含む cAbs 溶液を、相対湿度 60% (各スポットあたり 0.4 nL、直径 ~ 200 μm) のインクジェットマイクロアレイスポッターでスライド上にスポットします。中心間間隔は400μmです。
   2. スナップ装置(図2)を使用して、ニトロセルロースコーティングされた(または官能化ガラス)アッセイスライドで転写スライドをスナップし、cAb液滴をアッセイスライドに移します。
      1. スナップ装置の側面にある6つのボタンすべてを90度回して、すべてのプランジャーを引っ張って開いた位置にロックします。トランスファースライドをレセプタクルのスライドホルダーに挿入し、クリップされた角を固定ポゴピンに向けてください。最初の3つのボタンのセットを回して、金色のポゴピンでプランジャーを解放し、スライドが位置合わせピンに押し付けられていることを確認します。
      2. ニトロセルロースコーティングされたスライドをスナップ装置に逆さまに挿入し、4つのポゴピンに座らせます。3つのボタンの2番目のセットを回して、銀色のピンでプランジャーを解放し、スライドが位置合わせピンに押し付けられていることを確認します。
      3. 正確な位置決めのために、位置合わせピラーと穴を使用してトップシェルをスライドホルダーに置き、スナップ装置を閉じます。
      4. 閉じたスナップ装置をケージに挿入し、クロージャータブを完全に押し下げて、適切な圧力をかけながらマイクロアレイを対面させます。1分間閉じたままにします。
   3. スライドを分離します。アッセイスライドを室温で1時間、相対湿度60%でインキュベートします。ステップ1.1.3〜1.1.5で説明されているように、アッセイスライドを洗浄、ブロック、および乾燥します。
   4. インクジェットスポッターデッキに別の転写スライドを置き、左下隅を押します。50 または 100 μg/mL の抗体(表 1 を参照)、20% グリセロール、および 1% BSA を PBS 中に含有したスポット dAb 溶液。各スポットが 0.8 nL で、スポット間の中心間間隔が 400 μm であることを確認してください。
   5. アッセイとトランスファースライドを保管します。アッセイスライドとトランスファースライドの両方を乾燥剤が入った密閉バッグに密封し、-20°Cの冷凍庫に入れます。

2. スナップチップを用いたマルチプレックスイムノアッセイ

1. アッセイスライドを冷凍庫から取り出します。スライドが室温になるまで、バッグを30分間密封したままにします。
2. 0.05% Tween-20 を含む PBS でタンパク質をスパイクすることにより、7 ポイント連続希釈サンプル溶液を調製します。
   手記：ここでは、5倍の希釈係数が使用されます。各タンパク質の開始濃度を表1に示します。
3. 適宜、試料溶液を調製してください。例えば、ヒト血清をPBSTバッファーで4倍に希釈します。
4. 16コンパートメントガスケットをアッセイスライドにクランプします。
5. ピペッティングにより、8ウェルの1カラムに7種類のタンパク質希釈溶液とタンパク質を含まないPBST緩衝液を充填します。同じスライド上の他の8つのウェルのサンプル溶液をピペットで披露します。
   注:各ウェルに80μLの溶液を収めることができます。必要に応じて、より多くのスライドを使用して追加のサンプルを測定できます。
6. サンプルを450rpmのシェーカーで室温で1時間、または4°Cで一晩インキュベートします。スライドをPBSTで450rpmで3回、毎回5分間洗浄します。ガスケットを取り外し、窒素ガスの流れの下でスライドを乾燥させます。
7. dAbsを使用したトランスファースライドを冷凍庫から取り出します。バッグを室温で30分間密封しておきます。次に、60%の湿度安定化ビーズが入った密閉チャンバー(空のチップボックスなど)でスライドを20分間インキュベートし、水分補給します。
8. スナップ装置(図2)を使用して、転写スライドをアッセイスライドにスナップし、dAb液滴を転写します。スナップ装置の操作については、セクション1.2.2を参照してください。
9. スライドを分離します。アッセイスライドを60%湿度安定化ビーズを含む密閉チャンバー内で1時間インキュベートします。アッセイスライドを16コンパートメントガスケットでクランプし、PBSTを使用して450rpmでスライドを450rpmで4回、毎回5分間すすぎます。
10. PBS中の2.5 μg/mLストレプトアビジンフルオロフォアを含む溶液80 μLを各ウェルにピペットで移します。シェーカーで450rpmで20分間インキュベートします。
11. スライドをPBSTで3回、シェーカーで蒸留水で1回450rpmですすいでください。ガスケットを取り外し、窒素ガスを使用してスライドを乾燥させます。

3. スライドスキャンとデータ解析

1. 635 nmレーザーを使用して、蛍光マイクロアレイスキャナーでアッセイスライドをスキャンします。
2. 分析ソフトウェア(array-pro analyzerなど)を使用して、各スポットの正味強度を抽出します。
3. 統計ソフトウェアを使用して各タンパク質の検出限界(LOD)を計算し、サンプル中のタンパク質濃度を決定します。
   手記：LOD は、標準曲線の Y 切片に 3 つの独立したアッセイの標準偏差の 3 倍増加したものとして定義されます。

>表1. 50プレックスアッセイのバッファー中のタンパク質濃度とLOD。CA 15-3 の LOD は U/ml (*) です。

名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 の 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 の 名 名 名 名 名 名 の 名 名 の 名 名 名 名 の 名 名 名 名 名 名 名 の 名 名 名 名 名 名 名 名

タンパク質名	開始濃度(ng/ml)	LOD(pg/ml)	タンパク質名	開始濃度(ng/ml)	LOD(pg/ml)
ANG2	500	1.3 × 104	IL-6b	1	2.1 × 102
BDNFの	500	1.0 × 102	IL-5	50	77
CA 15-3*	1	4.9 × 103	IL-4	1000	1.5 × 104
CEAの	1000	5.4 × 103	IL-2	50	76
CXCL10/IP-10	50	1.7 × 102	LEPの	200	4.0 × 102
CRPの	200	44	ミグ	500	11 × 102
英語	1000	6.2 × 102	CCL3/MIP-1α	50	3.3
EGFの	50	1.8 × 102	CCL4/MIP-1β	50	12
EGFR	200	1.9 × 102	MMP-3	500	1.0 × 102
FAS-L	500	4.5 × 102	M-CSFの	500	8.2 × 103
FGFの	500	1.0 × 103	MMP-9	200	3.1 × 102
G-CSFの	500	39	CCL2/MCP-1	50	55
GM-CSFの	50	3.8	NCAM-1	500	1.7 × 103
グロα	50	3.0 × 102	β-NGFの	200	1.4 × 103
HER2	500	3.5 × 103	NT-3	200	5.8 × 102
PDGF-BBシリーズ	200	73	OPNの	500	1.9 × 103
IL-1β	500	7.9 × 102	RBP4	200	1.2 ×102
IL-1ラ	200	1.1 × 103	SPARC	1000	4.6 ×104
IL-15	50	8.2 × 102	TNF-α	50	4.4
IL-12	1	30	TNF-RI	50	1.3 × 102
IL-11	500	1.2 × 103	TNF-RIIの	50	12
IL-10	500	6.1 ×102	FAS/TNFRSF6	200	2.8 ×102
IL-8	50	6.6	uPA	200	24
IL-7	2.5	26	uPAR(CD87)	200	76
IL-6a	1000	84	ベグフ	200	6.7 × 102

結果

図 1.(a)シングルトランスファー法と(b)ダブルトランスファー法を比較したアッセイ手順の概略図。

図 2.シングル転送とダブル転送の違いを示す回路図。(a)転写試薬のミラーリングは、スライドとインクジェットXYステージとの間の角度のずれを増幅します。(b)ダブルトランスファー方式により、角度のずれを克服します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水錠剤	フィッシャーサイエンティフィック	5246501EA
ストレプトアビジン結合Cy5	ロックランド	S000-06
Tween-20 (トゥイーン 20	シグマ・アルドリッチ	p1379
ウシ血清アルブミン	ジャクソン免疫研究所	001-000-162
グリセロール	シグマ・アルドリッチ	G5516
ブロッキングソリューション:BSAフリーのStabilGuard Choice Microarray Stabilizer	SurModics株式会社	SG02
ニトロセルロースコーティングスライド	グレース・バイオラボラトリーズ(株	305116
アミノシランコーティングスライド	ショットノースアメリカ	1064875
スナップデバイス	パラレックス・バイオアッセイ株式会社	PBA-SD01
インクジェットマイクロアレイスポッター	GeSiMの	ナノプロッター2.0
スライドモジュールガスケット	グレース・バイオラボラトリーズ(株	204862
湿度安定化ビーズ	パラレックス・バイオアッセイ株式会社	PBA-HU60
Array-Pro Analyzerソフトウェア	メディアサイバネティックス	バージョン 4.5
蛍光マイクロアレイスキャナー	アジレント	SureScanマイクロアレイスキャナー
生物統計学ソフトウェア	GraphPadソフトウェア	GraphPad プリズム6
エンドグリン捕捉抗体	R&Dシステム	MAB10972
エンドグリンタンパク質	R&Dシステム	1097-JP
エンドグリン検出抗体	R&Dシステム	BAF1097
IL-6a(表1参照)	R&Dシステム
IL-6b(表1参照)	インビトゲン

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