同一宿主種由来の一次抗体を用いたマルチプレックス免疫染色法

Abstract

出典:Lyu, Q., et al. Microscopewaving and fluorophore-tyramide for multiplex immunostaining on mouse advreals − using unconjugated primary antibodies from the same host species.J. Vis. Exp. (2020年)。

このビデオでは、同じ宿主種由来の一次抗体を用いてマルチプレックス免疫染色を行うアッセイを実演しています。この方法では、副腎組織切片が2段階の免疫染色プロセスを経ます。最初に、切片を皮質のマーカーに特異的な抗体で染色し、続いて結合した抗体を剥がし、髄質のマーカーに特異的な抗体で再染色します。

Protocol

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 最初の抗体による染色

1. ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)スライドを脱ろうおよび再水和し、次の各ステップに5分間を割り当てます:キシレンまたは同等の試薬3倍、100%エタノール2倍、95%エタノール1倍、70%エタノール1倍、50%エタノール1倍、および蒸留水2倍.
   手記：スライドは、この水分補給ステップから最終ステップの取り付けまで湿ったままにしておく必要があります。
2. 任意の抗原賦活化のために、スライドを275 mLの沸騰クエン酸ナトリウム溶液(10 mM、pH = 6.0)に8分間入れます。溶液を沸騰させ続けるには、スライドを蓋付きの14 x 9.5 x 9 cm³(W x L x H)ピペットチップボックスの底に平らに置き、700 Wの電子レンジで70 %の電力で溶液を8分間電子レンジで加熱します。次に、ピペットチップボックスを電子レンジから取り出し、蓋を開けて、溶液を室温(RT)で少なくとも20分間冷まします。
3. スライドをPBST(0.1%ポリソルベート20/80を含むリン酸緩衝生理食塩水)を含むCoplinジャーに移します。PBSTで5分間3回洗浄します。すぐに次のステップに進まない場合は、このステップ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
退色防止封入剤	ベクターラボラトリーズ	H-1000
ビオチン化ロバ抗マウス	ジャクソンイムノ	〒715-066-151	1:500希釈
ビオチン化ロバ抗ウサギ	ジャクソンイムノ	〒711-066-152	1:500希釈
ダピ	バイオレジェンド	422801	蒸留水で2 μg/mL
蛍光顕微鏡	エコー	リボルブ4
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン	ジャクソンイムノ	016-030-084	1:1000希釈
電子レンジ、700W	ゼネラル・エレクトリック	JEM3072DH1BB
マウス抗CYP2F2	サンタクルス	SC-374540	1:250希釈
マウス抗TH	サンタクルス	SC-25269	1:1000希釈
通常のロバ血清	ジャクソンイムノ	017-000-121	PBST中の2%血清
ウサギ抗20αHSD	ケラファスト、	EB4002	1:500希釈
ウサギ抗-3βHSD	トランスジェニック、	コ607	1:250希釈
ウサギ抗TH	ノーバス	NB300-109	1:1000希釈
ウサギ抗β-カテニン	アブカム、	AB32572	1:500希釈
ストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ(SA-HRP)	ジャクソンイムノ	016-303-084	1:1000希釈
TSA Cy3チラミド	パーキンエルマー	SAT704B001EA	1:100希釈
TSAフルオレセインチラミド	パーキンエルマー	SAT701001EA	1:100希釈