サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 最初の抗体による染色
- ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)スライドを脱ろうおよび再水和し、次の各ステップに5分間を割り当てます:キシレンまたは同等の試薬3倍、100%エタノール2倍、95%エタノール1倍、70%エタノール1倍、50%エタノール1倍、および蒸留水2倍.
手記：スライドは、この水分補給ステップから最終ステップの取り付けまで湿ったままにしておく必要があります。
- 任意の抗原賦活化のために、スライドを275 mLの沸騰クエン酸ナトリウム溶液(10 mM、pH = 6.0)に8分間入れます。溶液を沸騰させ続けるには、スライドを蓋付きの14 x 9.5 x 9 cm3(W x L x H)ピペットチップボックスの底に平らに置き、700 Wの電子レンジで70 %の電力で溶液を8分間電子レンジで加熱します。次に、ピペットチップボックスを電子レンジから取り出し、蓋を開けて、溶液を室温(RT)で少なくとも20分間冷まします。
- スライドをPBST(0.1%ポリソルベート20/80を含むリン酸緩衝生理食塩水)を含むCoplinジャーに移します。PBSTで5分間3回洗浄します。すぐに次のステップに進まない場合は、このステップでスライドをPBSTとともにCoplinジャーにRTで数時間、または次のステップにすぐに進まない場合は4°Cで1〜2日間保存します。
- ブロッキング溶液を調製するには、ブロッキング試薬として二次抗体の宿主分子種の正常血清を使用します。他の市販のブロッキング試薬も使用できます。この研究で提示された研究に採用された正常な血清を使用する場合は、100 μL の正常なロバ血清を 4.9 mL の PBST に加えてください。ブロッキング溶液は、4°Cで最大3日間保存できます。
- ブロッキングには、スライドからPBSTを振り落とし、十分なブロッキング溶液ですばやく覆います。スライドをRTで加湿チャンバー内で30分間インキュベー
トします。
- ブロッキング溶液を使用して一次抗体溶液(スライド2枚分500 μL)を調製し、一次抗体を目的の濃度に希釈します。溶液は使用まで氷上に保管する必要があります。
- 3β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(3βHSD)の場合、2 μLの3βHSD抗体を498 μLのブロッキング溶液に加えます。
- チロシンヒドロキシラーゼ(TH)の場合は、0.5 μLのTH抗体を499 μLのブロッキング溶液に加えます。
- β-カテニンの場合は、1 μLのβ-カテニン抗体を499 μLのブロッキング溶液に加えます。
- 20α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(20αHSD)の場合、20αHSD抗体1 μLを499 μLのブロッキング溶液に加えます。
- シトクロムP450 2F2(CYP2F2)の場合、2 μLのCYP2F2抗体を498 μLのブロッキング溶液に加えます。
- スライドからブロッキング溶液を振り落とし、十分な一次抗体溶液で素早く覆うことにより、一次抗体とインキュベートします。スライドを加湿チャンバー内で4°Cで一晩インキュベートします。インキュベーション中、スライドは乾燥を防ぐために小さなパラフィンフィルムで覆われることがあります。
- 翌朝、スライドをPBSTで5分間3回洗浄します。
- ブロッキング溶液を使用して二次抗体溶液(スライド2枚分500 μL)を調製し、ビオチン化二次抗体を所望の濃度(例:ロバ抗マウス抗体1 μLまたはロバ抗ウサギ抗体をブロッキング溶液499 μL)に希釈します。溶液は使用まで氷上に保管する必要があります。
- スライドからPBSTを振り落とし、十分な二次抗体溶液で迅速に覆うことにより、2番目の抗体とインキュベートします。スライドを加湿チャンバー内でRT.
で1時間インキュベートします
手記：内因性ビオチンが懸念される場合は、ビオチン化二次抗体の代わりにペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用してください。ステップ1.10でペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用する場合は、ステップ1.14にジャンプします。
- スライドをPBSTで5分間3回洗浄します。
- 西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン(SA-HRP)溶液(スライド2枚で500 μL)を調製し、0.5 μLのSA-HRPを499 μLのPBSに加えます。最終濃度は1μg/mLです。
- SA-HRP溶液でインキュベートします。スライドからPBSTを振り落とし、スライドを十分なSA-HRP溶液ですばやく覆います。スライドを加湿チャンバー内で室温で0.5時間インキュベー
トします。
- スライドをPBSTで5分間3回洗浄します。
- 製造元の指示に従って、蛍光色素チラミドを希釈バッファーで希釈することにより、フルオロチルアミド溶液を調製します(例:5μLのフルオロフォアチラミドを496μLの希釈バッファーに
)。
- フルオロフォアチラミドを用いたシグナル現像は、スライドからPBSTを振り落とし、スライドを十分なフルオロフォアチラミド溶液で迅速に覆います。加湿チャンバー内で室温で1分間インキュベートします。インキュベーション時間は、所望の蛍光強度を得るために調整することができる。スライドをPBSTを含むCoplinジャーに移すことにより、反応を停止します。スライドをPBSTで3分間2回洗浄します。
- この段階では、蛍光顕微鏡でシグナルを迅速にチェックし、結果を確認することができます。カバースリップを使用しない場合は、各切片にグリセロール:PBS(1:1)を一滴垂らして、サンプルを湿らせます。スライドをPBSTで3分間2回洗浄します。スライドは、次のステップに進む前に、PBSTに4°Cで数日間保存できます。
2. 最初の抗体を剥がす
- スライドを275mLの沸騰クエン酸ナトリウム溶液(10 mM、pH = 6.0)に少なくとも8分間入れます。蓋付きの14 x 9.5 x 9 cm3(W x L x H)ピペットチップボックスの底にスライドを平らに置き、700 Wの電子レンジで700 MHzの電力で溶液を8分間電子レンジで電子レンジにかけます。ストリッピング時間を長くすることが望ましい場合は、スライドを常にバッファー溶液に浸しておくために、沸騰クエン酸ナトリウム溶液を使用してバッファーを補充する必要があります。ピペットチップボックスを電子レンジから取り出し、蓋を開けて、溶液をRTで少なくとも20分間冷まします。
- スライドをPBSTが入ったCoplinジャーに移します。PBSTで5分間3回洗浄します。次のステップがすぐに実行されない場合は、スライドをPBST入りのCoplinジャーにRTで数時間、または4°Cで1〜2日間保存します。
3. 2つ目の抗体で染色
する
- ブロッキング手順から開始し、手順 1.5 から手順 1.14 と同じ手順に従います。シグナル開発ステップ(ステップ1.15およびステップ1.16)では、異なる蛍光スペクトルでフルオロフォアチラミドを使用します><。
手記： この方法を使用してスライドを数回剥がすと、マルチプレックス染色が可能になります。最後の抗体は、レポーターとしてフルオロフォアチラミドを必要としません。蛍光色素標識二次抗体は、最後の一次抗体からのシグナルを示すために使用される場合があります。
- 核対比染色が必要な場合は、スライドを2 μg/mLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)またはヘキスト溶液と室温で1分間インキュベートします。次に、スライドをPBSTで3分間2回洗浄します。
