方法論記事

免疫療法耐性T細胞亜集団を解析するためのマルチプレックス免疫蛍光イメージング

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、腫瘍組織に浸潤するT細胞のさまざまな亜集団を分析するためのin-situ蛍光マルチスペクトルイメージング技術を示しています。腎細胞がん組織凍結切片は、特異的な阻害性受容体を発現し、免疫療法抵抗性の表現型を示すCD8+ T細胞を標識する抗体で処理されます。標識された切片をマルチスペクトル顕微鏡を用いて可視化し、異なるCD8+ T細胞亜集団を同定します。

プロトコル

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サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています

1. 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のin situ免疫蛍光染色

  1. 手続き上のガイドライン
    1. すべての実験ステップを室温で実行します。
    2. すべてのステップで、Tris Buffer Saline(TBS、材料表を参照)で希釈します。
    3. TBSでの洗浄は、一次抗体のインキュベーション後を除くすべてのステップで行ってください。後者の場合は、Tris Buffer Saline Tween20(TBST、材料表を参照)を使用します。バッファーの組成と再構成については、表1を参照してください。
    4. 抗体のインキュベーションには湿度チャンバーを、洗浄には染色ジャーを使用してください。
    5. 処置中に切片を乾かさないでください。
  2. 前処理
    1. 組織サンプルが入ったスライドを解凍し、ペーパータオルで標本の周りのスライドを注意深く乾かします。組織を含む反応領域を疎水性バリアペンで区切ります(材料の表

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結果

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図1:扁桃腺パラフィン包埋組織上のCD8-PD-1-Tim-3免疫染色。凍結保存された切片の代わりにパラフィン包埋組織切片をトリプル免疫染色のために選択しました。脱ロウと再水和の後、以前に凍結保存された切片に対して開発されたのと同じ染色プロトコルを適用しました。CD8+ T細胞は胚中心の外側に位置し、PD-1を発現する非CD8+ T細胞は胚中心にクラスター化しています。顕微鏡の倍率は20倍で、スケールバーは20μmを表します。

figure-results-2
図2:腎細胞がん組織標本の自動解析。明視野画像(A

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開示事項

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利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Vectra 3 自動定量病理イメージングパーキン・エルマーCLS142338
inForm細胞解析 2.1.パーキン・エルマーCLS135781
Rソフトウェアhttps://www.r-project.org
Dakopen区切りペンダコS2002
トリスバッファー生理食塩水TBS錠タカラバイオ株式会社TAKT9141ZpH7.6 100錠
トリスバッファー生理食塩水Tween20 TBS(+Tween20)タカラバイオ株式会社TAKT9142ZpH 7.6 100錠
ビオチンブロッキングシステムダコX0590アビジン0.1%およびビオチン0.01%
通常のロバ血清ジャクソン免疫研究017-000-0015% vol./vol.濃度
DAPI付きフルオロシールドシグマアルドリッチF60571.5 μg/mL の濃度
ニッテルガラスカバースリップKnittel Gläser、10003924x60 mm 100カバースリップ
ウサギ抗CD8クローンP17-VノーバスNBP1の790554μg/mLで使用
マウス anti-PD-1 クローン NATアブカムAB525872 μg/mLで使用
ヤギの反Tim-3研究開発AF23653 μg/mLで使用
ウサギ抗PD-L1クローンSP142ロシュ73094570011 μg/mLで使用
マウスAF647標識パンケラチンクローンC11細胞シグナル伝達45280.5 μg/mLで使用
ヤギ反ヒトgal9研究開発AF20450.3 μg/mLで使用
シアン5共役ロバアンチウサギジャクソン免疫研究711-175-1525 μg/mLで使用
ビオチン化F(ab'2)ロバ抗マウスIgGジャクソン免疫研究〒715-066-1503 μg/mLで使用
Alexa Fluor488 コンジュゲートロバ抗ヤギ IgGアブカムab150133 (英語5 μg/mLで使用
Cy3標識ストレプトアビジンアマルサムPA430013 μg/mLで使用
ネガティブコントロールマウス IgG1ダコX09312 μg/mLで使用
ヤギ血清由来のIgGシグマアルドリッチI52563 μg/mLで使用
ウサギ血清由来IgGシグマアルドリッチI50064μg/mLで使用
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タグ

TCD8 TPD 1Tim 3

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