免疫療法耐性T細胞亜集団を解析するためのマルチプレックス免疫蛍光イメージング

要約

出典:Granier, C., et al. Multiplexed Immunofluorescence Analysis and Quantification of Intratumoral PD-1⁺ Tim-3⁺ CD8⁺ T Cells. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、腫瘍組織に浸潤するT細胞のさまざまな亜集団を分析するためのin-situ蛍光マルチスペクトルイメージング技術を示しています。腎細胞がん組織凍結切片は、特異的な阻害性受容体を発現し、免疫療法抵抗性の表現型を示すCD8+ T細胞を標識する抗体で処理されます。標識された切片をマルチスペクトル顕微鏡を用いて可視化し、異なるCD8+ T細胞亜集団を同定します。

プロトコル

サンプル収集を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています

1. 腫瘍浸潤リンパ球(TIL)のin situ免疫蛍光染色

1. 手続き上のガイドライン
   1. すべての実験ステップを室温で実行します。
   2. すべてのステップで、Tris Buffer Saline(TBS、材料表を参照)で希釈します。
   3. TBSでの洗浄は、一次抗体のインキュベーション後を除くすべてのステップで行ってください。後者の場合は、Tris Buffer Saline Tween20(TBST、材料表を参照)を使用します。バッファーの組成と再構成については、表1を参照してください。
   4. 抗体のインキュベーションには湿度チャンバーを、洗浄には染色ジャーを使用してください。
   5. 処置中に切片を乾かさないでください。
2. 前処理
   1. 組織サンプルが入ったスライドを解凍し、ペーパータオルで標本の周りのスライドを注意深く乾かします。組織を含む反応領域を疎水性バリアペンで区切ります(材料の表を参照)。2分間乾燥させます。
   2. サンプルを100%アセトンに5分間固定し、2分間乾燥させた後、TBSで10分間洗浄します。
3. 飽和と封鎖
   1. スライドを3滴のアビジン0.1%で10分間前処理し、スライドをタップまたはフリックしてアビジンを分散させ、気泡を取り除き、次にビオチン0.01%を3滴(材料の表を参照)、タップ、および/またはフリックして10分間処理します。TBSで洗ってください。
   2. Fc受容体遮断を行います。.TBSで希釈した5%容量/容量の正常血清100 μLを塗布し、標識された二次抗体または三次抗体と同じ宿主種由来の血清を使用します(材料の表を参照)。ここではロバの血清を使用しました。30分間インキュベートします。
   3. インキュベーション中に、抗CD8、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)、およびT細胞免疫グロブリンおよびムチン含有タンパク質-3(Tim-3)抗体を短時間遠心します(材料表)。表2に示すように、TBS中の一次抗体の混合物を調製します。
4. CD8、PD-1、およびTim-3の免疫染色
   1. 一次抗体混合物を調製します。使用した抗体(抗CD8、PD-1、Tim-3、およびそれらに対応する二次抗体)とその濃度については、材料の表と表2を参照してください。
   2. 残りのロバの血清をタップまたはフリックします(手順1.3.2で追加)。スライドを100 μLの非標識一次抗体混合物と加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。
   3. インキュベーション中に、Cyanine 5抗ウサギ抗体、Alexa Fluor 488-抗ヤギ抗体、およびビオチン化抗マウス抗体を短時間遠心し、表2に記載されているように二次抗体の混合物を調製します。
   4. TBSTでスライドを5分間洗浄し、スライドを乾かします。
   5. スライドを100 μLの二次抗体と加湿チャンバー内で30分間インキュベートします。
   6. 表2に記載されているように、シアニン3-ストレプトアビジンを含む三次抗体の混合物を調製します。
   7. スライドをTBSで10分間洗い、スライドを乾かします。
   8. スライドを100 μLの三次抗体混合物と30分間インキュベートします。
   9. スライドをTBSで10分間洗い、スライドを乾かします。
5. セル実装
   1. スライドを4',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)含有封入剤(1.5 μg/mL DAPI)に、蛍光顕微鏡法に対応したカバースリップ(材料表参照)に埋込します(材料表参照)
      手記：各実験のネガティブコントロールとして、アイソタイプマッチした抗体を含むスライドを1枚、対応する抗体と同じ濃度で使用しました。この染色には、マウスIgG1、ウサギIgG、およびヤギIgG陰性のコントロール抗体を使用しました(材料表を参照)。ポジティブコントロールとして、テストしたマーカーに対して陽性であることが知られているヒト過形成性扁桃腺を各実験に使用しました。典型的な染色は、結果に記載されています(図1)。CD8、PD-1、およびTim-3のモノ染色は、DAPIを使用せずに、同じ前処理で個別に(スライドごとに1回の染色)行う必要があります。抗体を一切使用せず、DAPI封入剤のみを使用した同じ実験条件でのスライドも実施する必要があります。スライドは、抗体やDAPIを使用せずに、同一の実験条件でイメージングする必要があります。

2. 蛍光解析と自動細胞カウント

1. 自動顕微鏡による画像取得
   1. プロトコルを作成します。
      1. 自動顕微鏡ソフトウェアと蛍光イルミネーターの電源を入れます。
      2. メニューバーで、[ファイル]、[プロトコルの作成]をクリックし、[DAPI]、[FITC]、および[TRITC]を選択します。
      3. 「Next」、「Tissue section」の順にクリックし、「Next」→「Protocol name」をクリックします。「CD8-PD-1-Tim-3」などの名前を選択し、「Next」をクリックして「Save」をクリックします。
      4. ステージにスライドを手動で配置します。
      5. メニューバーで「setup」と「settings」をクリックし、新しいウィンドウで「Set home Z」をクリックします。
      6. ポジコントロールスライド、すなわち、DAPIサンプルでCD8、PD-1、およびTim-3をトリプル染色して露光時間を調整します。
      7. コントロールバーで、「露出を設定」をクリックします。
      8. 各フィルターの露光時間を調整して、十分ではあるが飽和していない信号が得られるまで
      調整します。
      9. モノクロイメージングの場合は、次の手順を実行します。
      10. acquisitionを選択し、[autofocus]でDAPIフィルターを選択します。
      11. 「スキャンエリア制限」で、対物レンズをスライドの左上隅に移動します。「マーク」をクリックします。右下隅についても同じことを行います。
          手記：このステップでは、低電力イメージング(LPイメージング)の領域を4倍で区切ります。シリーズのすべてのサンプルを囲むようにマークをしっかりと配置してください。
      12. ハイパワー(HP)イメージングの場合は、次の手順を実行します。
      13. [オートフォーカス] で [DAPI] を選択します。
      14. [Acquisition] バンドで [DAPI]、[FITC]、[Cy3]、および [Cy5] を選択します。「OK」をクリックします。メニューバーの「File」と「Save protocol」をクリックします。
   2. スライドをスキャンします。
      1. メニューバーから「File」と「Load protocol」をクリックして、プロトコルをロードします。「開始」をクリックします。
      2. 「ラボID」(画像保存用のフォルダの場所)を入力します。スライドを識別するために、スライド ID を入力します。「次へ」をクリックします。
      3. 「Monochrome Imaging」をクリックします(明るい視野光の下でスライド全体をスキャンし、4倍の対物レンズを使用して連続画像を取得します).
         手記：これにより、スライドのグレースケールの概要が生成されます。
      4. 「Find Specimen」をクリックします。低解像度でスキャンする組織の領域を選択します(4倍):「Ctrl」キーを押しながらカーソルを使用してフィールドをクリックし、フィールドを選択または選択解除します(図2A)。
      5. 「LP Imaging」(4x Imaging)をクリックすると、各フィールドの蛍光レッドブルーグリーン画像を取得できます。
      6. HPフィールドを選択するには、「Ctrl」キーを押しながらカーソルを使用してフィールドをクリックし、高解像度(20倍)でスキャンする組織領域に対応するフィールドを選択または選択解除します。5 つのフィールドを選択します (図 2B)。
      7. 「HP Imaging」(20x imaging)をクリックすると、各フィールドのマルチスペクトル画像取得が可能になります(図2C)。
      8. 「Data Storage」をクリックすると、LabID.
         の冒頭で選択したフォルダに画像が保存されます。 手記：このプロセスを要約し、図 2 に示します。各ステップ(組織検出、フィールド選択)について、ユーザーがアルゴリズムをインクリメントしてトレーニングし、全自動スキャンプロセスを実現できます。

>表1:TBSとTBSTのバッファ構成。TBSは、抗体の混合および希釈に使用されます。洗浄では、TBSTが推奨される一次抗体後の洗浄を除き、すべてのステップがTBSで行われます。

の の

	TBS系	TBSTの
トリス-HCl	0.05メートル	0.05メートル
NaCl	0.15メートル	0.15メートル
トゥイーン 20	-	0.05パーセント
pH	7.6	7.6
準備	500mLに1錠H2O

>表2:CD8-PD-1-Tim-3免疫蛍光染色用の詳細な抗体ミックス組成物。一次抗体、二次抗体、および三次抗体の各混合物について、対応するTBS容量で行う希釈液を、総容量1mLに対して与える。1枚のスライドについて、組織面積が^2cm2の場合、総反応量は100μLです。

一次抗体の量			最終V=1mL
ウサギ抗CD8	マウス抗PD-1	ヤギの反Tim-3	TBS系
1.6 μL	2 μL	30μL	966.4μL
二次抗体の量
シアン5アンチウサギ	ビオチン化抗マウス	Alexa Fluor 488 アンチヤギ	TBS系
3.3 μL	2 μL	2.5 μL	992.2
三次抗体の量
	Cy3標識ストレプトアビジン		TBS系
	3.3 μL		996.7

結果

図1:扁桃腺パラフィン包埋組織上のCD8-PD-1-Tim-3免疫染色。凍結保存された切片の代わりにパラフィン包埋組織切片をトリプル免疫染色のために選択しました。脱ロウと再水和の後、以前に凍結保存された切片に対して開発されたのと同じ染色プロトコルを適用しました。CD8+ T細胞は胚中心の外側に位置し、PD-1を発現する非CD8+ T細胞は胚中心にクラスター化しています。顕微鏡の倍率は20倍で、スケールバーは20μmを表します。

図2:腎細胞がん組織標本の自動解析。明視野画像(A

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Vectra 3 自動定量病理イメージング	パーキン・エルマー	CLS142338
inForm細胞解析 2.1.	パーキン・エルマー	CLS135781
Rソフトウェア	https://www.r-project.org
Dakopen区切りペン	ダコ	S2002
トリスバッファー生理食塩水TBS錠	タカラバイオ株式会社	TAKT9141Z	pH7.6 100錠
トリスバッファー生理食塩水Tween20 TBS(+Tween20)	タカラバイオ株式会社	TAKT9142Z	pH 7.6 100錠
ビオチンブロッキングシステム	ダコ	X0590	アビジン0.1%およびビオチン0.01%
通常のロバ血清	ジャクソン免疫研究	017-000-001	5% vol./vol.濃度
DAPI付きフルオロシールド	シグマアルドリッチ	F6057	1.5 μg/mL の濃度
ニッテルガラスカバースリップ	Knittel Gläser、	100039	24x60 mm 100カバースリップ
ウサギ抗CD8クローンP17-V	ノーバス	NBP1の79055	4μg/mLで使用
マウス anti-PD-1 クローン NAT	アブカム	AB52587	2 μg/mLで使用
ヤギの反Tim-3	研究開発	AF2365	3 μg/mLで使用
ウサギ抗PD-L1クローンSP142	ロシュ	7309457001	1 μg/mLで使用
マウスAF647標識パンケラチンクローンC11	細胞シグナル伝達	4528	0.5 μg/mLで使用
ヤギ反ヒトgal9	研究開発	AF2045	0.3 μg/mLで使用
シアン5共役ロバアンチウサギ	ジャクソン免疫研究	711-175-152	5 μg/mLで使用
ビオチン化F(ab'2)ロバ抗マウスIgG	ジャクソン免疫研究	〒715-066-150	3 μg/mLで使用
Alexa Fluor488 コンジュゲートロバ抗ヤギ IgG	アブカム	ab150133 (英語	5 μg/mLで使用
Cy3標識ストレプトアビジン	アマルサム	PA43001	3 μg/mLで使用
ネガティブコントロールマウス IgG1	ダコ	X0931	2 μg/mLで使用
ヤギ血清由来のIgG	シグマアルドリッチ	I5256	3 μg/mLで使用
ウサギ血清由来IgG	シグマアルドリッチ	I5006	4μg/mLで使用

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