感染細胞におけるウイルスタンパク質の局在化のための免疫蛍光法

要約

出典:Samrat, S. K. et al., 免疫蛍光共焦点顕微鏡による単純ヘルペスウイルス1タンパク質の核から細胞質への転座の時間的分析。J. Vis. Exp.(2018年)

このビデオは、単純ヘルペスウイルス-1感染における感染細胞タンパク質0、ICP0の輸送を監視する方法を示しています。de novo合成後、ICP0は核に移動し、感染の進行中に細胞質に移動します。免疫蛍光顕微鏡は、タンパク質の細胞内局在を明らかにして分析し、感染段階全体での輸送に関する洞察を提供します。

プロトコル

1. 細胞播種とウイルス感染

1. ウイルス感染の20〜24時間前に、ヒト胚性肺(HEL)線維芽細胞または他の細胞の5 x 10⁴を、成長培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM))の4ウェル11 mmスタッガードスライドで検査します。細胞を37°Cで5%二酸化炭素(CO₂)とインキュベートします
   手記：各ウェルは、感染時に70〜80%の細胞密度を持っている必要があります。
2. 翌日、増殖培地を取り出し、Medium-199のウイルスを細胞に4〜10 pfu/cellの範囲で感染させます。ウイルス感染細胞を37°Cで1時間インキュベートし、インキュベーション期間中はスライドを揺らし続けます。
3. 1時間のインキュベーション後、Medium-199を取り出し、増殖培地を補充します.
   手記：さまざまな感染段階を妨害する薬物は、このステップで、またはウイルス吸収の前に追加することができます。
4. ウイルス感染細胞を5% CO₂と共に37°Cでインキュベートし、さまざまな感染期間でインキュベー
トします。

2. 固定と透過化

1. 適切な感染時期に、感染した細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回迅速に洗浄し、PBSで新たに調製した4%パラホルムアルデヒドを200μL加えます。細胞をパラホルムアルデヒドと室温で8〜10分間インキュベートし、各ウェルに細胞を固定します。
2. パラホルムアルデヒドを吸引し、ウェルを200μLのPBSで3回洗浄します。3^回目の洗浄後、PBSを完全に吸引します。
3. 各ウェルに0.2%非イオン性界面活性剤100 μLを添加し、細胞を5〜10分間透過処理します。
4. 非イオン性界面活性剤を吸引し、200μLのPBSでウェルを3回洗浄します。

3. 免疫蛍光染色

1. PBSを完全に吸引し、各ウェルにブロッキングバッファー200 μL(1%ウシ血清アルブミン(BSA)および5%ウマ血清PBS)を添加し、室温で1時間または4°Cで一晩インキュベートします。
2. 感染細胞タンパク質0に対する一次抗体の実験的に測定された濃度の一次抗体(ウサギ抗ICP0ポリクローナル抗体)をブロッキングバッファーに添加し、一次抗体を室温で2時間または4°Cで一晩インキュベー
トします。
3. ブロッキングバッファーで3回、10分間のインキュベーションで洗浄します。Alexa 594標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(ブロッキングバッファーで1:400に希釈)を添加し、スライドを室温で1時間インキュベートします。次に、スライドをブロッキングバッファーで10分間隔で3回洗浄します。
4. 最後に、スライドをPBSで一度洗浄して、残留BSAと馬の美容液を取り除きます。
5. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む退色防止封入剤を1滴加えてスライドを埋込みし、透明なマニキュアを使用してカバースリップで密封します。

4. 共焦点イメージング

1. 共焦点顕微鏡を使用して、Alexa 594の場合は590〜650 nm、DAPIの場合は410〜520 nmに波長を設定します。1024 x 1024 の画像形式とライン平均 8 を選択して、高解像度の画像を取得します。
2. 4ウェルスライド上の各ウェルを共焦点顕微鏡で分析します。図1と図2に示すように、100倍対物レンズの下で代表的な細胞画像を取得します。
3. 多数のセルをカウントするには、40倍対物レンズの下で連続するフィールドの画像を撮ります.
   手記：各感染の各時点から200を超える感染細胞を蓄積するには、5〜10枚の画像が必要です。
4. 各実験では、比較する必要のあるすべてのサンプルについて、一定の共焦点パラメータで写真を撮ります。

>5. 核分布と細胞質分布の分析

1. 共焦点アプリケーションソフトウェアでプロジェクトを開きます。ICP0の核分布と細胞質分布について細胞を表にする必要がある画像を選択します。
2. トップメニューの「Quantity」タブをクリックし、ツールメニューから「Sort ROIs」を選択します。
3. トップメニューから「線を引く」を選択して、分析するセルを横切る縦線を引きます。
   手記：ICP0とDAPIの両方の線に沿った蛍光強度を示すヒストグラムが表示されます。ヒストグラムでは、青い線はDAPIピクセルを表し、核の境界を示し、赤い線はICP0ピクセルを表しています。
4. バックグラウンド染色に基づいて、ICP0強度の閾値を一定に設定し、各実験でICP0の細胞内分布を解析します。
   1. 図2に例示されているように、赤信号が平均して核領域の閾値を下回っているが、青の境界を越えると閾値を上回っている場合は、赤信号が主に細胞質に位置していると分類します。
   2. 赤色のシグナルが核全体で閾値を上回り、青色のシグナルの境界を超えている場合は、赤色のシグナルを核と細胞質の局在化としてグループ化します。
   3. 赤色の信号が原子核の閾値を上回っているが、平均して青色の信号の境界の外側で閾値を下回っている場合は、赤色の信号を核局在化としてグループ化します。
5. 各サンプルから異なる感染時間における200個以上の感染細胞を表にし、棒グラフでプロットして、時間に応じたICP0の動きを示します(図3)。

結果

図1:HSV-1感染中のICP0の動的トラフィック。4ウェルスライドで増殖させたHEL細胞をプロトタイプHSV-1(F株)に10 pfu/cellで感染させました。感染後1時間、5時間後、9時間後(hpi)に細胞を固定し、透過処理し、ウサギ抗ICP0およびマウス抗PML一次抗体に反応させた後、Alexa 594標識抗ウサギおよびAlexa 488共結合抗マウス二次抗体に反応させて、100倍対物レンズ下でのイメージングを行いました。前骨髄球性白血病(PML)タンパク質は、感染時のPML分解により5hpiおよび9hpiで消失するND10核体のマーカータンパク質として機能します。スケールバー = 10 μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞とウイルス
ヒト胚性肺線維芽細胞(HEL細胞)	トーマス・E・シェンク博士(プリンストン大学)		HEL細胞は、10% FBSを添加したDMEMで増殖しました
HSV-1ウイルス株(F株)	バーナード・ロイズマン博士研究室
中程度
ダルベッコの修正イーグルスミディアム(DMEM)	インビトゲン	11965-092
ウシ胎児血清(FBS)	シグマ	F0926-500ミリリットル
ミディアム-199 (10X)	ギブコ	11825-015
試薬
4ウェル11mmスタッガードスライド	セルライン/サーモフィッシャーサイエンティフィック	30-149H-ブラック
16%パラホルムアルデヒド溶液(w / v)メタノールフリー	サーモサイエンティフィック	28908
トリトンX-100	フィッシャー試薬	BP151-1C0
ウシ血清アブミン(BSA)	カルバイオケム	CASの9048-46-8
ホースセラム	シグマ	H1270 さん
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, pH7.4)	Dr. Haidong Gu
NaCl	フィッシャーバイオ試薬	BP358-212
KH2PO4	フィッシャーバイオ試薬	BP362-500
KClの	フィッシャーサイエンティフィック	BP366-500
Na2HPO4	フィッシャーバイオ試薬	BP332-500
ブロッキングバッファー(1%BSAおよび5%ウマ血清を含むPBS)	Dr. Haidong Gu
Rabiit 抗ICP0抗体	Dr. Haidong Gu
PML(PG-M3)-マウスモノクローナルIgG	サンタクルスバイオテクノロジー	SC-966
Alexa Fluor 594-ヤギ抗ウサギIgG	インビトゲン	A11012(英語)
Alexa Fluor 488-ヤギ抗マウスIgG	インビトゲン	A11001 (英語)
DAPI付きベクタシールドマウティングメディウム	ベクターラボ	H-1200
パスツールピペット	フィッシャーブランド	13-678-20D
ネールポリッシュ	サリー・ハンセン
備品
共焦点顕微鏡	ライカSP8
共焦点ソフトウェア	Leica LAS X アプリケーションスイート
Excelソフトウェア	マイクロソフトエクセル
HERAcell 150i CO2 インキュベーター	サーモサイエンティフィック	注文コード:51026282