マウス肺に存在する自然免疫細胞と適応免疫細胞を同定するためのin vitro法

要約

出典:Christofides, A., et al. Flow Cytometric Analysis for Identification of the Innate and Adaptive Immune Cells of Murine Lung. J. Vis. Exp. (2021).

このビデオは、マウスの肺に存在する免疫細胞を同定するin vitro技術を示しています。マウスの肺組織から標的免疫細胞を単離した後、自然免疫細胞および適応免疫細胞上の特定のマーカーに対する蛍光色素タグ付き抗体のカクテルを使用して表面標識します。さらに、単球、マクロファージ、樹状細胞は、細胞内マーカーを使用して標識されます。次に、フローサイトメトリーを使用して、さまざまな免疫細胞タイプを同定します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 外科的切除と組織調製

1. 1 mLのトリブロモエタノールを腹腔内に注入することにより、マウスを安楽死させます(標準プロトコルに従って調製しました。資料一覧表).
   手記：CO₂窒息は、肺の損傷を引き起こし、肺免疫細胞の特徴と特性を変化させる可能性があるため、肺の研究では避けるべきです。頸部脱臼は、肺の機械的損傷を引き起こす可能性があるため、避ける必要があります。
2. マウスを清潔で専用のエリアに移し、外科手術を行います。
3. マウスの背側を下にして、4つの四肢に針またはテープを使用して安定させます。70%エタノールを使用して、腹側領域の皮膚を消毒します。
4. 首から腹部まで、皮膚を切開します。胸部から皮膚を慎重に取り除きます。
5. 胸骨と肋骨を慎重に取り外します。
6. 18〜21Gの針を使用して、10 mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を右心室に直接注入することにより、肺が完全に白くなるまで肺を洗い流します。.
7. 肺に触れずに胸腺と心臓を慎重に取り除きます。
8. 肺を周囲の組織から静かに切り離し、冷たいウシ血清アルブミン(BSA)緩衝液(表1)を入れたチューブに移します(表1).
   手記：単一細胞懸濁液をさらに調製する前に、肺から隣接するすべての脂肪を除去する努力をする必要があります。

2. シングルセル懸濁液の調製

1. 肺を空のシャーレに移し、2つの細かいメスで刻みます。ミンチした肺のすべての部分を新しい50mLコニカルチューブに移します。5 mLの消化緩衝液を使用してプレートを洗浄し、ミンチした肺(表1)を含む50 mLチューブに加えます。
   手記：消化バッファーは、使用直前に調製する必要があります。5 mg/mLのコラゲナーゼを使用します。1 mgまたは5 mgのコラゲナーゼをBSAバッファーまたはタンパク質を含まないPBSと組み合わせても、結果は改善されませんでした(図1)。
2. チューブの蓋を固定し、オービタルシェーカーで37°Cで150rpmの速度で肺を30分間消化し、10mLの冷たいBSAバッファーを加えて反応を停止します。
3. 消化後、18Gの針を使用して肺片を混合して溶解します。新しい50 mLコニカルチューブの上部に70 μmのフィルターストレーナーを置きます><。 手記：より小さなミクロンフィルターを使用すると、主要な骨髄系集団が失われる可能性があります。
4. 消化された肺混合物をゆっくりとストレーナーに直接移します。10 mLシリンジプランジャーのゴム面を使用して、フィルター上の残りの肺片を粉砕します。.フィルター上の処理された材料をBSAバッファーで洗浄します。
5. シングルセル懸濁液を350 × gで4°Cで8分間遠心分離します。
6. 上清を慎重に廃棄し、細胞を1 mLのアンモニウム-塩化-カリウム(ACK)溶解バッファーに再懸濁します。1 mLピペットを使用してよく混合し、室温で90秒間インキュベートします。
7. 10 mLの冷たいBSAバッファーを加えて反応を停止し、350 × gで4°Cで7分間遠心分離します。上清を慎重に廃棄し、ペレットを染色バッファーに再懸濁して、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
8. 細胞を5 × 10⁶細胞/mLの濃度で再懸濁し、表面染色に使用します(セクション2を参照)
   手記：この目的のために、細胞を96ウェルの丸底プレートに播種し、続いて抗体染色および洗浄します。プレート式遠心分離機が利用できない場合は、プレートの代わりにフローチューブを使用してください。このプロトコルでは、平均サイズの6-10週齢のC57BL/6マウスから、肺あたり~15-20×10個の⁶細胞を得ることができます。

3. 表面抗体染色

1ウェルあたり
1. 200 μL中、1×10⁶細胞を96ウェルプレートに移します。プレートを350 × gで4°Cで7分間遠心分離します。その間に、抗16/32抗体を染色バッファー(表1)で希釈(1:100)してFcブロック溶液を調製します。
2. 調製済みのFcブロッキング溶液(Table of Materials)の50 μLに細胞を再懸濁し、4°Cまたは氷上で15〜20分間インキュベー
トします。
3. 150 μLの染色バッファーを加え、プレートを350 × gで4°Cで5分間遠心分離します。その間、表面抗体カクテルを調製するには、表面抗体を希釈して(1:100;表2)染色バッファー.
   注:(i)Fcブロッキング用の抗-16/32抗体は、同じ混合物中の表面抗体と一緒に使用できます。(ii)固定可能な生存率色素を使用する場合は、1:1,000の希釈で表面抗体カクテルに添加してください。
4. 調製済みの表面抗体カクテル50 μLに細胞を再懸濁し、暗所で4°Cで30〜40分間インキュベートします。細胞を染色バッファーで2回洗浄します.
   手記：細胞内染色が不要な場合は、細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁し、フローサイトメーターでのデータ取得に直接進みます。あるいは、細胞を固定して4°Cで保存し、後で取得することもできます。24時間以内にフローサイトメトリーに細胞を使用することをお勧めします。

4. 細胞固定と細胞内染色

1. FoxP3/転写因子染色バッファーセットの固定/透過濃縮液3部と固定/透過希釈液1部を混合して、固定/透過化バッファー(Fix/Perm Buffer)を調製します(表1)。
2. セクション3で説明したように細胞を播種した96ウェルプレートのウェルあたり、あらかじめ調製したFix/Perm Bufferの50 μLに細胞を再懸濁し、暗所で4°Cで20〜25分間インキュベー
トします。
3. 10x透過化バッファーを精製脱イオン水で1:10に希釈し、1x透過化バッファーを調製します。
4. 細胞を1x透過化バッファーで1回洗浄します。その間、細胞内抗体(1:100)を1mLの透過化緩衝液で希釈することにより、細胞内抗体カクテルを調製します。
5. 96ウェルプレートの細胞あたり50 μLの調製済み表面抗体カクテルを使用して細胞を再懸濁し、暗所で4°Cで40分間インキュベー
トします。
6. 細胞を透過化バッファーで1回洗浄し、染色バッファーで1回洗浄します。最終洗浄後、細胞を200 μLの染色バッファーに再懸濁します
   手記：プレートリーダー付きのフローサイトメーターが利用できない場合は、細胞をフローサイトメトリーチューブに移します。
7. フローサイトメーターでサンプルあたり最低1.5×10個の⁶細胞を取得します.
   手記：単色および未染色のコントロールサンプルの場合、サンプルあたり0.5-1×10⁶細胞で十分です。最適な染色を達成し、コストを削減するために、使用する個々の抗体の力価を測定することをお勧めします。本プロトコールは、FoxP3染色バッファーセットを使用して調製したFix/Perm Bufferを使用して最適化されています。CD68は細胞質であり、核マーカーではないため、低濃度のパラホルムアルデヒドやさまざまなベンダーのサイトフィックス/サイトパーmキットなどの他の透過化ソリューションで十分かもしれません。

>表 1: バッファー。

BSAバッファ	PBS + 0.5% ウシ血清アルブミン
消化バッファー	予温(37 °C)BSAバッファー + 5 mg/mLコラゲナーゼ1型 + 0.2 mg/mL DNase I
染色バッファー	PBS+2.5%FBSの
フィックス/パーマバッファ	Foxp3/転写因子染色バッファーセットの固定・透過希釈液3部と固定・透過希釈液1部
透過化バッファー	精製脱イオン水で10倍に希釈したFoxp3/Transcription Factor染色バッファーセットの10倍透過化バッファー

>表2:モノクローナル抗体の使用。

の さん の シリーズ の ) の の さん の の 型 の の の の 名

抗原	クローン	蛍光色素	希釈	表面/細胞内
CD45	30-F11	APC/CY7	1:100	表面
GR-1	RB6-8C5	BV421	1:100	表面
CD68	FA-11	パーCPCy5.5	1:100	細胞
CD11bの	M1/70	PECy7	1:100	表面
シグレックF	S17007L	フィッツ	1:100	表面
CD11c	N418	BV650 または BV510	1:100	表面
CD64	X54-5/7.1	PE/ダズル594	1:100	表面
MHC-II.(英語)	M5/114.15.2	AF700	1:100	表面
CD103	2.00E+07	PE / FITC(英語	1:100	表面
ライブ/デッドフィックス可能ファーリードデッドセルステインキット		FarRed(APC)またはAqua(BV510)	1:1000	表面
CD3	17A2	PE	1:100	表面
B220	RA3-6B2	AF488	1:100	表面
NK1.1	PK136	フィッツ	1:100	表面
CD24	30-F1の	PE	1:100	表面
MERTの	2B10C42	PE	1:100	表面
F4/80	BM8	BV605	1:100	表面
CX3CR1	SA011F11	PE	1:100	表面
FcBlock(CD16/32)	93		1:100	表面

結果

図1:予熱したPBS + 0.5% BSA中の5 mg/mLのコラゲナーゼ1によって、最良の細胞解離が達成されます。 すべての異なる条件で、0.2 mg の DNAse I も含まれていました。略語:BSA =ウシ血清アルブミン;FSC-A = 前方散乱光のピーク面積。L / D =生/死んだ染色;SF = シグレック F.

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 mLシリンジプランジャー	エクセリント	26265
18G針	BDプレシジョングライドニードル	305165
21G針	BDプレシジョングライドニードル	305195
50 mLコニカルチューブ	隼	3520
70 μmセルストレーナー	サーモフィッシャー	22363548
96ウェルプレート	ファルコン/コーニング	3799
ACKライジングバッファー	サーモフィッシャー	A10492-01
抗マウスCD11b	バイオレジェンド	101215	詳細については、表 2 を参照してください
抗マウスCD11c	バイオレジェンド	117339 / 117337	詳細については、表 2 を参照してください
抗マウスCD45	バイオレジェンド	103115	詳細については、表 2 を参照してください
抗マウスCD64	バイオレジェンド	139319	詳細については、表 2 を参照してください
抗マウスCD68	バイオレジェンド	137009	詳細については、表 2 を参照してください
アンチマウスGR-1	バイオレジェンド	108433	詳細については、表 2 を参照してください
抗マウスSiglec F	バイオレジェンド	155503	詳細については、表 2 を参照してください
アベルティン	シグマ・アルドリッチ	240486
B220	バイオレジェンド	103228	詳細については、表 2 を参照してください
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	9048-46-8
CD103	バイオレジェンド	121405 / 121419	詳細については、表 2 を参照してください
CD24	バイオレジェンド	138503	詳細については、表 2 を参照してください
CD3	バイオレジェンド	100205	詳細については、表 2 を参照してください
遠心機
コラゲナーゼ1型	ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション	LS004196
CX3CR1	バイオレジェンド	149005	詳細については、表 2 を参照してください
DNase I	ミリポアシグマ	10104159001
エタノール
F4/80	バイオレジェンド	123133	詳細については、表 2 を参照してください
FcBlock(CD16/32)	バイオレジェンド	101301	詳細については、表 2 を参照してください
ウシ胎児血清	R&Dシステム
細かい鋸歯状の鉗子	ロボズ外科用器具株式会社
Foxp3 / 転写因子染色バッファーセット	サーモフィッシャー	00-5523-00
Futura安全メス	メリットメディカルシステムズ	SMS210
ライブ/デッドフィックス可能ファーリードデッドセルステインキット	サーモフィッシャー	L34973	詳細については、表 2 を参照してください
MERTの	バイオレジェンド	151505	詳細については、表 2 を参照してください
MHC-II.(英語)	バイオレジェンド	107621	詳細については、表 2 を参照してください
NK1.1	バイオレジェンド	108705	詳細については、表 2 を参照してください
オービタルシェーカー	VWRの	モデル200
ペトリ皿	隼	351029
冷蔵卓上遠心分離機	ソーヴァル ST 16R
小さな湾曲したハサミ	ロボズ外科用器具株式会社

名 名 さん の の の