ウイルス感染細胞におけるカスパーゼ媒介性ウイルスおよび宿主タンパク質の切断の評価

要約

出典:Husain, M. インフルエンザAウイルス感染中にタンパク質を切断するカスパーゼとそのモチーフの特定。J. Vis. Exp. (2022年)

このビデオは、ウイルス感染細胞におけるカスパーゼを介したタンパク質切断を評価する方法を示しています。ウイルス感染後、カスパーゼは活性化され、さまざまな宿主細胞タンパク質やウイルス核タンパク質を分解しますが、特定のカスパーゼ阻害剤はこの分解を防ぎます。

プロトコル

1. インフルエンザAウイルス、IAV感染細胞のタンパク質の切断または分解の評価

1. 1ウェルあたり3 x 10⁵ Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) or A549 cells per well in a 12-well cell culture plate.
   手記：MDCK細胞を使用する場合は、目的のタンパク質に対する抗体がそのイヌ種を認識していることを確認してください。
2. ウェルをペアで播種します、すなわち、コントロールペア-1つは非感染模擬サンプル用、もう1つは感染モックサンプル用、テストペア-1つは非感染阻害剤Aサンプル用、もう1つは感染阻害剤Aサンプル用です。追加の阻害剤ごとにペアの数を増やします。.
3. 細胞を37°Cで5%_CO2雰囲気下で一晩インキュベートします。
4. 翌日、細胞をIAV(H1N1サブタイプまたは別のサブタイプ)に感染させます。
   1. このためには、ウイルスストックを400μLの無血清最小必須培地(MEM)(材料の表を参照)で希釈することにより、ウイルス接種物を調製し、感染の多重度(MOI)が0.5〜3.0プラーク形成単位(pfu)/細胞(MOIを計算する際の細胞数の倍増の要因)で調製します
      手記：MDCK細胞に感染させるには、ウイルス接種物にトシルフェニルアラニルクロロメチルケトン(TPCK)-トリプシンを最終濃度1μg/mLで補充します。
5. 古い培地を細胞から取り出し(ステップ1.3)、1 mL/ウェルの無血清MEM 2xで細胞を洗浄します。
6. 400 μLのウイルス接種物(ステップ1.4.1)を細胞に加え、5%二酸化炭素(CO₂)雰囲気下で35°Cで1時間インキュベー
トします。
7. その間に、カスパーゼ阻害剤(Z-DEVD-FMKなど)、リソソーム阻害剤(塩化アンモニウム、_NH4Clなど)、またはプロテアソーム阻害剤(MG132など)(材料表を参照)をそれぞれ最終濃度40 μM、20 mM、または10 μMで無血清MEMで希釈します(材料表を参照)。).後者の2つの阻害剤は、コントロールとして機能します。阻害剤の1つを無血清培地で再構成するために使用した溶媒(水以外の場合)を等量
希釈します。
8. ウイルス接種物を取り出し、ステップ1.5(1x)のように細胞を洗浄します。
9. 無血清MEM(1 mL/ウェル)をモックまたはインヒビターで補充して細胞に添加し、ステップ1.6のように細胞をインキュベートします。この時点は 0 時間の感染と見なされます。
10. 24時間後、1mLのシリンジプランジャー(ゴム側)で細胞を掻き取り、1.5mLのポリプロピレンチューブに移します。
11. チューブを12,000 x gで室温で1〜2分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を採取します。
    手記：この上清は、廃棄するか、放出されたウイルス子孫の力価を測定するためのプラークアッセイに使用することができます。
12. ステップ1.11のように、細胞ペレットを250 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再遠心分離して洗浄します。
13. 上清を除去し、80-100 μLの細胞溶解バッファー(50 mM Tris(ヒドロキシメチル)アミノメタン(THAM)塩酸塩(Tris-HCl)、pH 7.4、150 mM塩化ナトリウム(NaCl)、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、1%Triton X-100、および1x protease inhibitorカクテル、材料表を参照)を加えて細胞を溶解します。
14. チューブを98°Cで10分間加熱し、全細胞ライセートを完全に溶解して調製します。ライセートを4°Cで保存し、翌日にステップ1.15〜1.17を実行しますが、最良の結果を得るには、これらのステップを同じ日に完了してください。
15. ビシンコニン酸(BCA)テーブルアッセイキットを使用して、各サンプル中のタンパク質量を推定します(材料の表を参照)。
16. 標準的なSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)と分子量マーカーにより、非感染サンプルと感染サンプルから同量のタンパク質を分離します。
17. タンパク質をニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に移します(材料の表を参照).
    手記：PVDFメンブレンは、一部のウェスタンブロットイメージャーで高いバックグラウンドを提供する場合があります。互換性を確認します。
18. ウェスタンブロッティングを実施して、他の場所で説明した方法を使用して目的のタンパク質を検出します。
19. 模擬治療と阻害剤治療の感染サンプルレーンのタンパク質レベルを比較します。
    手記：カスパーゼ阻害剤で処理された感染サンプルレーンでタンパク質レベルが回復した場合、タンパク質はカスパーゼによって切断または分解されます。そうでなければ、リソソームまたはプロテアソームのいずれかによって分解されます。
20. 同じ実験の少なくとも 3 回の繰り返しから各レーンのバンド強度を測定し、対応するローディングコントロールバンドで標準化することにより、タンパク質回収率を定量化します。
21. 最新のイメージャーと関連ソフトウェア(Table of Materialsを参照)を使用して、ウェスタンブロットをイメージングし、タンパク質回収率を定量化します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A549セル	ATCCの	CRM-CCL-185	ヒト、上皮、肺
塩化アンモニウム	シグマ・アルドリッチ	A9434
カスパーゼ3阻害剤	シグマ・アルドリッチ	264156-M	別名「InSolution Caspase-3 Inhibitor II - Calbiochem」
完全なミニプロテアーゼ阻害剤カクテル	ロシュ	11836153001
ヤギ抗NP抗体			リチャード・ウェビー(セント・ジュード・チルドレンズ・リサーチ・ホスピタル、メンフィス、アメリカ)からMHへの寄贈
MDCK細胞	ATCCの	CCL-34	犬、上皮、腎臓
MG132	シグマ・アルドリッチ	M7449
最小エッセンシャルメディウム(MEM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11095080	必要に応じて、L-グルタミン、抗生物質、またはその他のサプリメントを追加します
Odyssey FcイメージャとImage Studio Liteソフトウェア5.2	リコー		Odyssey FcはOdyssey XFに、Image Studio LiteソフトウェアはEmpiria Studioソフトウェアに置き換えられました。
Pierce BCAタンパク質アッセイキット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23225
Protran Premiumニトロセルロースメンブレン	サイティバ(フォーマリーGEヘルスケア)	10600003
ウサギ抗アクチン抗体	アブカム	AB8227
ウサギ抗コルタクチン抗体	細胞シグナル伝達	3502
SeeBlue Pre-stained Protein Standard	サーモフィッシャーサイエンティフィック	LC5625
トリスHCl、NaCl、SDS、デオキシコール酸ナトリウム、トリトンX-100	メルク
トリプシン、TPCK処理	シグマ・アルドリッチ	4370285

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