蛍光抗菌薬プローブの細菌細胞内蓄積量を測定するアッセイ

要約

出典:Stone, M. R. L., et al. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (2020).

このビデオは、細菌細胞内の蛍光抗生物質プローブの蓄積を測定するアッセイを示しています。排出ポンプ阻害剤への曝露は、細菌細胞の膜貫通プロトン勾配を乱し、その上に蛍光色素結合抗生物質が添加されます。プロトン勾配の乱れによる排出ポンプの阻害は、細菌内部に抗生物質の蓄積を引き起こします。細菌細胞を溶解し、蛍光強度を測定して抗生物質の蓄積を確認します。

プロトコル

1. 抗菌活性の評価

>注:細菌を含むすべての作業は、アッセイまたは実験室の汚染を避けるために、無菌条件下で実施する必要があります。すべての培地は使用前にオートクレーブ滅菌し、プラスチック製品やピペットなどの機器は無菌状態に保つ必要があります。作業は生物学的封じ込めフード(タイプ2)で行うことをお勧めします。

1. 抗生物質の足場に適した細菌株のグリセロールストックを溶解性ブロス寒天培地(LB、製造元の指示に従って調製)にストリークし、37°Cで一晩成長させます
   手記：抗菌活性をテストする細菌の選択は、使用する抗生物質の足場に基づいて行う必要があります。抗生物質に感受性があることが知られている種から5〜10種類の細菌の代表的な範囲を選択する必要があります。これは、ラボのロジスティック能力を考慮に入れた上でのことです。可能であれば、耐性菌もテストする必要があります。以下に示すプロトコルはほとんどの細菌に有効ですが、特別な条件(CO₂、特殊培地など)が必要かどうかを確認し、必要に応じて変更を加えます。これらの条件を用いてアッセイに成功した細菌には、ブドウ球菌、連鎖球菌、桿菌、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、エンテロコッカス・フェシウムなどがあります。
2. プレートから1つのコロニーを選び、5 mLの陽イオン調整ミューラーヒントンブロス(CAMHB、メーカーの指示に従って調製)で37°Cで一晩培養します。
3. 一晩培養液をCAMHBで~40倍に希釈し、中対数相、光学密度600 nm(OD₆₀₀)= 0.4–0.8、容量5 mL)まで増殖します。
4. 各蛍光系抗生物質のストック溶液を滅菌水に1.28 mg/mLで調製し、10 μLの抗生物質を96ウェルプレートの最初のカラムにピペットで移します。
5. 90 μL の CAMHB を最初のカラムに加え、50 μL を他のすべてのウェルに加えます。次に、プレート全体で連続2倍希釈を行います。
6. 十分に混合し、中対数期の培養物を~10⁶コロニー形成単位(CFU)/mLに希釈し、すべてのウェルに50 μLを添加して、最終濃度を~5 x 10⁵ CFU/mLにします
   培養量(mL)=(培地容量(mL)/(OD₆₀₀ x 1,000)
   例えば、OD₆₀₀ = 0.5 を所望の培地容量 12 mL で培養する場合、12 mL の培地に (12/(0.5 x 1,000) = 0.024 mL の培養
物を添加します
7. プレートを蓋で覆い、振とうせずに37°Cで18〜24時間インキュベートします。
8. プレートを目視検査し、MICは目に見える成長のない最も低い濃度の井戸です。
   手記：活性および不活性蛍光抗菌薬の例については、表1を参照してください。

2. 分光光度法によるプローブ蓄積の解析

>注:これらの遠心分離時間は大腸菌に対して最適化されているため、他の種についてはわずかな変更が必要な場合があります。プローブ蓄積の代表的なデータは、NBD標識シプロフロキサシンプローブについて報告されています。

1. 細菌株のグリセロールストックをLB寒天にストリークし、37°Cで一晩成長させます。
2. プレートから1つのコロニーを選び、LBで37°Cで一晩培養します。
3. 培地で一晩で~50倍に希釈し、中対数期(OD₆₀₀ = 0.4–0.8)まで成長させます。
4. 培養物を1,470 x gで25分間遠心分離し、培地をデカントします。
5. 1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に細菌を再懸濁し、1,470 x gで15分間遠心分離します。
6. 培地をデカントし、洗浄したペレットをPBSに再懸濁して最終OD₆₀₀ = 2にします。
7. 必要に応じて、10.1 μLのシアン化カルボニル3-クロロフェニルヒドラゾン(CCCP、PBSで10 mM)を1 mLの細菌(最終濃度100 μM)に加え、37°Cで10分間インキュベートします< br /> 手記： CCCPは排出ポンプ阻害剤です。CCCPを追加することで、排出の影響を調べることができます。
8. 培養物を18,000 x gで20°Cで4分間遠心分離し、培地をデカントします。
9. 1 mLの蛍光抗生物質溶液(PBS中10〜100 μM)をペレットに加え、37°Cで30分間インキュベー
トします。
10. 培養物を18,000 x gで4°Cで7分間遠心分離し、培地をデカントします。
11. バクテリアを1mLの冷たいPBSに再懸濁し、手順2.9を繰り返します。
12. 手順2.10を合計4回繰り返します。
13. 必要に応じて、180 μLの溶解バッファー(20 mM Tris-HCl、pH 8.0、および2 mMナトリウムEDTA)を添加し、次に70 μLのリゾチーム(H₂Oに72 mg/mL)を加えて細菌を溶解します。
14. 37°Cで30分間インキュベートした後、3回凍結融解します(-78°Cで5分間、次に34°Cで15分間)。
15. サンプルを20分間超音波処理し、次に65°Cに30分間加熱します。
16. 溶解したサンプルを遠心分離し(18,000 x g、8分)、10 kDaのフィルターメンブレンでろ過します。
17. フィルターを100μLの水で4回洗浄します。
18. ライセートを平底の黒色96ウェルプレートに移し、蛍光色素に適した励起波長と発光波長のプレートリーダーで蛍光強度を測定します(すなわち、7-(ジメチルアミノ)-2-オキソ-2H-クロメン-4-イル[DMACA]:_λex=400 nm、λem=490 nm;ニトロベンゾオキサジアゾール[NBD]:_λex=475 nm、_λem=545 nm).
    手記： 蛍光NBD標識シプロフロキサシン系抗生物質を使用した細菌の分光光度分析の例については、図1を参照してください。

結果

>表 1. シプロフロキサシン、トリメトプリム、およびリネゾリドに基づく蛍光抗生物質プローブの、ブロス微量希釈MICアッセイによって測定された、適切な臨床的に関連する細菌株に対する抗生物質活性。ほとんどの場合、プローブは親薬と比較していくらか活性を失いましたが、測定可能な抗生物質の効力をいくらか保持していました(さらなる研究で役立つのに十分です)。

		MIC (μg/mL)
種	濾す	シプロ	シプロ-NBD

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Amicon Ultra-0.5遠心フィルターユニット、Ultracel-10メンブレン付き	メルク	UFC501096
Bruker Avance 600 MHz分光計	ブルカー
CCCP	シグマ・アルドリッチ	C2759
セライト545	シグマ・アルドリッチ	22140-5KG-F
サイゲル	ABCAMの	AB109204
FM4-64FX、FM4-64™メンブレンステインの固定可能なアナログ	ライフテクノロジーズオーストラリア Pt	F34653
ガンマ2-16 LSCplus凍結乾燥剤	キリスト
Hettich Zentrifugen Rotofix 32	ヘティヒ
ポンド	アムレスコ	J106
鶏卵白のリゾチーム 凍結乾燥粉末	シグマ・アルドリッチ	L6876
ミューラーヒントンIIブロスカチオン調整	ベクトン・ディキンソン	212322
シグマ1-15微量遠心分離機	シグマ・アルドリッチ
TECAN Infinite M1000 PRO	テカン

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