インターロイキン-10欠損マウスにおける糞便微生物叢移植の影響の評価

要約

出典:Xiao, Y. et al., インターロイキン10欠損マウスモデルにおける糞便微生物叢移植の治療的評価。J. Vis. Exp. (2022年)

このビデオは、結腸炎症のあるインターロイキン-10欠損マウスに糞便微生物叢移植の手順を示しています。腸内でコロニー形成された糞便微生物は二次代謝産物を放出し、抗炎症性サイトカイン放出を誘発し、結腸の炎症を軽減します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1.新鮮な糞便ペレットの収集

1. 滅菌ペーパータオル、鈍い端の鉗子、および50mLのコニカルチューブを準備します。
   1. ペーパータオルと鉗子を別々のオートクレーブバッグに入れ、180°Cの乾熱で30分間オートクレーブします。円錐形のチューブの重量を量り、チューブに重量を書き留めます。
2. 動物室のバイオセーフティキャビネットの電源を入れます。
3. オートクレーブ処理された清潔なマウスケージを寝具なしで取り、バイオセーフティキャビネットに入れます。カバーとフードラックを取り外し、キャビネットの中に置きます。
4. 滅菌済みのペーパータオルをケージの底に置き、金属製のラックをケージの上に戻します。
5. 年齢が一致した糞便ドナーを特定し、マウスケージをバイオセーフティキャビネットに入れます。ケージを開け、ドナーマウス(C57BL/6J)の尻尾をそっとつかみ、清潔なケージの上にある金属製のラックに置きます。
6. ケージカバーをラックの上に置き、動物が排便するのを待ちます。
   注意: 数匹のマウスの同腹仔を同時にラックに置きます。
7. 糞便ペレットを収集し、滅菌済みの50mLコニカルチューブに入れます。ペレットを性別でプールします。オスとメスから採取した糞便ペレットを混ぜないでください。
8. チューブの重量を再度重くし、糞便ペレットの重量を計算します。

2. 糞便懸濁液の調製

1. 滅菌溶液(生理食塩水中の10%グリセロール)を調製します。
2. 10 mLの10%グリセロール/通常の生理食塩水を、糞便ペレットの各グラムの円錐管に追加します.
   注:必要に応じて、溶液の量を20mLに増やします。この研究では、各ペレットに1mLの溶液(5〜10 mg)も使用しました。
3. ベンチトップホモジナイザーまたはドラフト内のブレンダーを使用して混合物を低速で均質化し、糞便を再懸濁します(3 X 30秒)。
4. 2層の滅菌綿ガーゼ(10.2 cm x 10.2 cm)で糞便懸 ?? 液をろ過します。.濾液を冷蔵庫で最大6時間一時的に保管するか、滅菌極低温バイアルに包装して-80°Cの冷凍庫に保管します。
5. ホモジナイザーまたはブレンダーは、標準的な手順に従って徹底的に清掃します。

>3. 経口強制経口による糞便懸濁液の投与

1. 凍結サンプルを使用する場合は、凍結した糞便懸濁液を氷上で解凍します。解凍した糞便懸濁液をボルテックスで混合します。
2. 新鮮または解凍した ?? 液を1 mLシリンジに移します.
   注:各マウスは合計200μLの糞便懸濁液を受け取り、対照群の各IL-10^-/-マウスは200μLの10%グリセロール/生理食塩水を受け取ります。
3. マウスの体重を量り、適切な強制針のサイズと最大投与量を選択します.
   注:体重が20〜25グラムのマウスの場合は、2.25mmのボールが付いた20Gの3.81cm湾曲した強制針を使用してください。詳しくは gavageneedle.com をご確認ください。
4. マウスの鼻の先端から剣状突起(胸骨の底)までの長さを測定して、強制針をテストします。シリンジに10%グリセロール/生理食塩水または糞便懸濁液を充填し、シリンジと針内の気泡を取り除きます><。 注意: 針が長さより長い場合は、鼻の高さで針シャフト/チューブに印を付けます。胃の穿孔を防ぐために、針/チューブをそのポイントを超えて動物に通さないでください。
5. バイオセーフティキャビネットにマウスケージを1つ置き、プラスチック製のケージカバーを取り外し、金属製のラックをそのままにしておきます。
6. 1つのマウスの尻尾をつかみ、金属製のラックに置きます。片手でマウスの尻尾を持ち、もう一方の手の親指と中指を使って、肩越しに皮膚をつかんで動物を拘束します。このようにして、前足が横に伸びるため、前足が針を押し出すのを防ぐことができます。動物の頭をゆっくりと後ろに伸ばし、片手で頭を所定の位置に保持します。
   注:実験に進む前に、実験者が完全な自信を持つまでマウスの操作を練習してください。
7. 強制針を口の中の舌の上に置きます。針が食道に到達するまで、上口蓋に沿ってゆっくりと進めます。1回の動きでなめらかに針を通します。抵抗が感じられる場合は、針を無理に押し込まないでください。針を取り出して、もう一度やり直してください。
8. 針が適切に配置され、確認されたら、針に取り付けられたシリンジを押して材料をゆっくりと投与します。針を回転させたり、針を前方に押したりしないでください。投与後、針をそっと引き出します。.
9. マウスをホームケージに戻します。苦しい呼吸や苦痛の兆候を探して、動物を5〜10分間監視します。FMTの12〜24時間後にマウスを再度監視します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
BDシリンジ、1 mL	フィッシャーサイエンティフィック	14-829-10階
鈍い端の鉗子	クニペックス	926443
C57BL/6Jマウス	ジャクソン研究室	664
遠心機	エッペンドルフ	5415Rの
コニカルチューブ	サーモフィッシャー	339650
湾曲した供給ニードル	ケントサイエンティフィック	FNC-20-1.5-2
グリセロール	ミリポアシグマ	G5516
IL-10ノックアウトマウス	ジャクソン研究室	4366名
USP生理食塩水	グレイン ジャー	6280
気化 器	安楽死株式会社	EZ-108SA

名 名 シリーズ