マウス海馬ニューロンの培養技術

要約

出典:Yang, R., et al. 軸索初期セグメントのアセンブリを研究するための初代培養海馬ニューロンの使用。 J. Vis. Exp. (2021)

ビデオは、マウスの海馬からニューロンを培養する方法を示しています。最初に、海馬は酵素消化を受けて細胞外組織マトリックスを分解します。その後、消化された組織は機械的に破壊され、個々のニューロンが分離されます。最後に、これらのニューロンをグリアフィーダー細胞上で培養します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. グリア細胞フィーダー皿の準備(培養日の2週間前)

1. 生後1日齢のマウス脳から皮質を解剖し、髄膜を剥がします。
2. きれいなベンチの上のきれいなペトリ皿にきれいなハサミで皮質組織をできるだけ細かく刻みます。
3. 刻んだ組織を12 mLのHBSSに移し、1.5 mLの2.5%トリプシンと1%(wt / vol)DNaseを加えます。.37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートし、5分ごとにスイングします。よく消化された組織は粘着性になり、大きなクラスターを形成します。10mLのピペットで10〜15回漸減して、組織を分解し、消化を改善します。
4. よく消化された組織を5mLピペットで10〜15回、ほとんどの塊が消えて培地が曇るまで回転させます。細胞ストレーナーを通過して残りのチャンクを取り除き、グルコース(0.6%wt/vol)、10%(vol/vol)ウマ血清、およびペニシリン-ストレプトマイシン(1x)を添加したグリア培地(最小必須培地(MEM))を15mL加えて消化を停止します。
5. 細胞を120 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引します。細胞ペレットを新鮮なグリア培地とシードで細胞培養皿(約10⁵細胞/ cm²)に再懸濁します。
6. 翌日、培地を新鮮なグリア培地と交換して、付着していない細胞を取り除きます。
7. 3〜4日ごとにグリア皿に新鮮なグリア培地を与えます。フラスコを手で5〜10回叩いて、緩く付着した細胞を取り除き、培地を交換します。
8. 10日間の培養後、グリア細胞はほぼコンフルエントになるはずです。グリア細胞を0.25%トリプシン-EDTAで分離し、新しい60 mm細胞培養皿に約10⁵個の細胞を播種します。残りの細胞は、将来の使用のために凍結することができます。
9. 培養日の3日前に、グリア培地をニューロン培養培地(Neurobasal-A Medium with 1x GlutaMAX-I and 1x B27 supplement)に変更します。

2. 海馬ニューロンの培養

>注:すべてのステップは室温で実行されます。

1. ANK3-E22/23f/fマウスの生後1日齢の子犬から6-8の海馬を、室温のペトリ皿でHBSS培地で解剖します。解剖ハサミで海馬を細かく刻みます。海馬をペトリ皿から15mLチューブに移します。
2. チューブ内で5mLのHBSSで海馬を2回洗浄します。洗濯後、海馬を1x HBSSの4.5mLに入れておきます。
3. 0.5 mLの2.5%トリプシンを4.5 mLのHBSSに加え、37°Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。チューブを5分ごとに反転させます。消化の良い海馬は粘着性になり、クラスターを形成するはずです。必要に応じて、消化をさらに5分間延長します。
4. 海馬をHBSSで3回、それぞれ5分間洗います。HBSSを取り外すために掃除機を使用しないでください。海馬を取り除くのはとても簡単です。
5. 洗浄後にHBSSを2mL加え、パスツールピペットで海馬を上下に15回ピペットで動かします。
6. ファイヤーポリッシュしたパスツールピペット(開口部の直径を半分に狭くする)でティッシュを10回回転させます。まだチャンクが残っていても、10回を超えないようにしましょう。オーバーシアリングはニューロンを殺します。
7. すべてのチャンクが底にセットされるまで、チューブを5分間休ませます。1 mLのピペットチップを静かに使用して、解離したニューロンを含む上清をプレーティングディッシュ(10⁵細胞/60 mmディッシュ)に移します。プレインキュベートしためっき培地に直接加え、プレートを軽く振ってください。
8. 残りのチャンクで手順2.6〜2.7を繰り返して、ほとんどのチャンクが消えるまで
繰り返します。
9. 播種後2〜4時間後、光学顕微鏡でめっき皿を確認します。ニューロンの大部分はカバースリップに付着しているはずです。付着したセルは丸くて明るいです。細い先端の鉗子を使用して、ワックスドット側が下を向くようにして、事前に調整されたニューロン培養培地を備えたグリア細胞フィーダー皿にカバースリップを反転させます。
10. ニューロンは、グリア細胞フィーダー皿内で最大1ヶ月間増殖することができます。7日ごとにニューロンに1 mLの新鮮なニューロン培養培地を供給します。
11. オプションのステップ:播種から1週間後、グリアの増殖を抑制するために、シトシンアラビノシド(1-β-D-アラビノフラノシルシトシン)を最終濃度5μMまで追加します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10xHBSSの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14065-056
18mmカバーガラス(1.5D)	フィッシャーサイエンティフィック	12-545-84-1D
2.5% トリプシン フェノールレッドなし	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14065-056
ANK3-E22/23f/fマウス	ジャックス	品番:029797
ポリ-L-リジン塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	26124-78-7
B27無血清サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A3582801
DMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11995073
GlutaMAX-Iサプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1286001
リポフェクタミン 2000	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11668030
アール塩とL-グルタミンによるMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11095-080
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103-049
D-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7021
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140122

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