凍結胚性ニューロンからの低密度初代ニューロン培養物の生成

要約

出典:Koganezawa, N. et al., 胚性海馬ニューロンの凍結ストックを用いた簡単で再現性の高い低密度初代培養。J. Vis. Exp. (2023年)

このビデオでは、凍結保存された胚性ニューロンの培養方法を示しており、解凍を制御し、神経基底培地で希釈し、ポリ-L-リジンでコーティングしたプレートに播種します。その後のインキュベーションは、ニューロン接続の成長と維持をサポートします。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. プレートコーティング

1. 96ウェルマイクロプレートにポリ-L-リジン(1 mg/mL、0.1 Mホウ酸緩衝液[pH:8.5]、100 μL/wellで希釈)でコーティングし、37 °C.
   で一晩インキュベートします。 手記：使用する必要のあるウェルのみをコーティングします。ここで行われる実験では、中央の60個の井戸が使用されます。ホウ酸緩衝液は、滅菌水に50 mMのホウ酸と12 mMのホウ酸を混合して調製します。
2. プレートを滅菌水(250μL /ウェル)で2回洗浄します。
3. サプリメントを含まない新鮮な培地(250 μL /ウェル)でプレートを一度洗浄します。
4. プレートを清潔なベンチで20分間乾燥させます。
5. プレートをアルミホイルで包み、使用するまで4°Cに保ちます(1か月間有効)。

2. セルシーディング

1. 50 μL/ウェルの培地をコーティングしたプレートに加え、37 °C、5% CO₂インキュベーターで30分間から1時間保持します。周辺ウェルに滅菌水(200 μL/ウェル)を入れます。
   手記：培地は、50x B-27、400x Glutamax、および100 U/mLのペニシリン/ストレプトマイシンを神経基礎培地に添加することによって調製されます(詳細については、材料の表を参照)。
2. ニューロンクライオバイアルを液体窒素タンクから取り出します。ここで使用したニューロンは、ジメチルスルホキシド凍結保存(DMSO凍結保存)ニューロンでした。
3. クライオバイアルを37°Cのヒートブロックに最大3分間浸漬し、内容物を部分的に解凍します。クライオバイアルを長時間温めすぎないでください。解凍後すぐに内容物を50mLチューブに移します。
4. ニューロンクライオバイアルの内容物を、幅広の細孔先端を備えた1mLピペットを使用して、滅菌済みの50 mLチューブに滴下(50 μL / s)ゆっくりと移します。
5. 空のクライオバイアルを1 mLの培地(室温;RT)。この1 mLの培養培地をクライオバイアルから滴下(50 μL/s)し、細胞懸濁液を含む50 mLチューブに移します。
6. 9 mLの培地(RT)を50 mLチューブに滴下(0.5 mL / s)し、容量を11 mLにします。ピペッティングを繰り返さず、細胞懸濁液をゆっくりと混合してください。
7. 細胞数をカウントします(セルカウンターまたは血球計算盤を使用します)。
8. すべての細胞懸濁液をリザーバーに移し、ワイドポアチップ(1.0 x 10⁴細胞/ウェル)を備えたマルチチャンネルピペットを使用して、細胞懸濁液を96ウェルプレートに分注します。培地の蒸発を減らすには、周辺ウェルに滅菌水を入れます(ステップ2.1)。
   手記：この研究は、培地交換のない3週間の培養では、培地の蒸発が小さいことを確認しています。培地の還元率は3.6%(n = 120ウェル)です。したがって、浸透圧の変化は3週間のインキュベーション期間中に急激ではありません。
9. ニューロンを37°C、5%_CO2インキュベーターで1〜2時間インキュベートします。
10. 培地をウェルあたり100 μLの予熱した培地(37 °C)と交換し、37 °C、5% CO₂インキュベーターに戻します(培養中に培地を交換する必要はありません)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
96ウェルプレート	ジオン(株)		才能のある
96ウェルプレート	グライナー	655986
B-27	ギブコ	17504-044	MEAプレートの場合は2 v/v%、ノーマルプレートの場合は50倍
ホウ砂	シグマ	B-9876	最終濃度 12 mM
ホウ酸	和光	021-02195	最終濃度 50 mM
ウシ血清アルブミン	ミリポア	12659から100G	最終濃度:PBSで3%
グルタマックス	ギブコ	35050-061	MEA プレートで 2.5 mM、ノーマルプレートで 400 倍
インセルアナライザー2200	サイティバ		蛍光画像
神経基礎	ギブコ	21103-049
ペニシリン/ストレプトマイシン	ギブコ	15140-122	100 U/mL(ノーマルプレート)
ペニシリン/ストレプトマイシン	ナカライ・テスク	26253から84	100 μg/mL(MEAプレート用
ポリ-L-リジン	シグマ	P2636	ホウ酸緩衝液で希釈(最終濃度:1 mg/mL)
スカスキーニューロン	アルズメッド株式会社	アーハ001	1.0 x 106細胞/チューブ

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