サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. ガラスカバースリップをポリ-L-リジンでコーティング
する
- ガラスカバースリップは、200 μg/mL ポリ-L-リジン(PLL)溶液の 5 mL アリコートを解凍して調製します。このストック溶液を45 mLの純粋な注射グレードの水を加えて、20 μg/mLに希釈します。溶液を新しい50 mLコニカルチューブにフィルター滅菌します。このチューブに「PLL Sterile」とラベルを付けます。
手記：室温で保存した水を使用して、霜取りプロセスをスピードアップします。
- 滅菌PLL溶液に100枚の滅菌丸型12 mmガラスカバースリップを追加します。チューブを5〜10分ごとに、2〜3分間攪拌して、コーティングが均一になるようにします。このようにカバースリップを1時間
手記：ドイツ製の丸いガラスカバースリップ(直径= 12 mm)は、信頼性の高い培養表面を提供し、24ウェル細胞培養プレートのウェルに容易に収まるため、好まれます。
- PLLコーティングを40分間行った後、ティッシュペーパーを2枚取り、フローキャビネットに平らに置きます。70%エタノールを使用して紙を滅菌し、平らにしてしわを取り除き、乾燥させます。
- ガラスカバースリップをPLLで1時間コーティングした後、余分なPLL溶液を取り除き、滅菌注射グレードの水を追加します。カバースリップを2〜3秒間静かに攪拌して、余分なPLLを取り除きます。このすすぎステップをさらに2回繰り返します。
- 余分な水分を取り除き、カバースリップを滅菌ティッシュペーパーに移します。湾曲した鉗子を使用して各カバースリップを慎重に分離し、乾かします.
手記：簡単にはじけないカバースリップは捨てることができます。あるいは、分離を助けるために少量の水を加えることもできます。
- 乾いたら、カバーガラスを24ウェル培養プレートに移します.
手記： カバースリップは、解剖プロセスを開始する約30分〜1時間前に準備する必要があります。プレートは、必要になるまで37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに保存できます。
2. 海馬組織と皮質組織の解離
- 細胞培養液の調製
- 神経組織の解離のために、まず細胞培養バッファーの40mLアリコートを解凍します(組成[mM]:116 NaCl、5.4 KCl、26 NaHCO3、1.3 NaH2PO4、1 MgSO4・7H2O、1 CaCl2・2H2O、0.5 EDTA・2Na・2H2Oおよび25 D-グルコース、 pH = 7.4)。12 mLの細胞培養バッファーを15 mLのコニカルチューブに計量します。「BSA」というラベルを付けます。5 mLの細胞培養バッファーを別の15 mLチューブに測定します。「papain」とラベル付けします。両方のチューブを水浴中で37°Cで15分間インキュベートします。
- 残りの細胞培養バッファーをフィルター滅菌し、「バッファー - 滅菌」とラベル付けし、必要になるまで4°Cで保存します。
- 120 mgのウシ血清アルブミン(BSA)を計量し、「BSA」とラベル付けされたチューブに加えます。.7 mgのパパインを計量し、「パパイン」とラベル付けされたチューブに追加します。.両方のチューブをウォーターバスに15分間戻します.
手記：パパイン粉末の移送を容易にするために、計量ボートに少量の緩衝液を追加すると便利です。
- すべての粉末が溶解したら、各溶液を新鮮な15 mLコニカルチューブにフィルター滅菌します。チューブパパインの場合、ろ過した溶液に「パパイン-滅菌」とラベルを付けます。.チューブBSAの場合、滅菌BSA溶液を3本のチューブに分割し、それぞれに4mLのBSA溶液を入れます。各チューブに「BSA - 滅菌」と「1」、「2」、または「3」のいずれかのラベルを付けます。すべてのチューブをウォーターバスに戻し、必要になるまで37°Cでインキュベートを続けます。
- 組織解剖の準備
- 35 mmの濾紙を1枚取り(「材料の表」を参照)、70%エタノールで滅菌します。100 mmのシャーレの蓋でフローキャビネットに入れて乾燥させます。海馬と皮質の解剖に必要なはさみ、鉗子、メス、へら(材料の表を参照)をレイアウトします。
- 2つの35mmペトリ皿と滅菌濾紙が入った100mmのペトリ皿をフローキャビネットの中央のアクセス可能な場所に置きます。
- トランスジェニックNexCreを収集します。解剖されるAi9およびVGATヴィーナスマウスの子犬。適切な励起フィルターと蛍光フィルター(材料の表を参照)を備えた蛍光灯を使用して、蛍光子と野生型の同腹仔を区別します。
- 動物を解剖する直前に、各35 mmシャーレに冷やした滅菌細胞培養バッファーを入れます
手記： 1つのシャーレは解剖の合間にツールを洗浄するためのもので、もう1つは海馬と皮質を収集するためのものです。
- 組織解剖
- 細胞培養バッファーを注いだらすぐに、出生後0〜2日目のトランスジェニックマウスまたはラットの子犬を大きく鋭利なハサミで斬首し、滅菌済みの100 mmシャーレを使用して頭部をフローキャビネットに移します。鉗子、はさみ、へらを使用して、トランスジェニック子犬の脳を滅菌フィルターペーパーに慎重に移します。
- タイプ22メスを使用して小脳を解剖し、2つの半球を分離します。小さなヘラを使用して、半球を横方向に転がします。各半球で、皮質が濾紙に接触するように静かに押し下げます。中脳領域をゆっくりと動かして、海馬と皮質を明らかにします.
手記： 半球を押さえ込むと細胞が押しつぶされる可能性があるときは、圧力をかけすぎないように注意してください。
- メスやヘラを使って、海馬と皮質を各半球から分離します。解剖した組織を、チルド細胞培養バッファーを入れた35 mmシャーレに移します
手記：複数の動物を解剖する場合は、滅菌細胞培養バッファーを氷上の50 mLコニカルチューブで保存してください。各解剖後、解剖した組織を冷却した細胞培養バッファーに移します。
- 皮質-海馬組織の解剖が成功したら、滅菌パパイン溶液をウォーターバスからフローキャビネットに移します。3 mLパスツールピペットを使用して、解剖した海馬と皮質を滅菌済みの35 mmシャーレの蓋に移します。タイプ22メスの平らな部分を使用して、組織が小さくなるまで十字に切ります。
- 少量のパパイン溶液を使用して、刻んだ組織をペトリ皿の蓋から滅菌パパインチューブに移します。.パパインチューブをウォーターバスに戻し、組織を37°Cで25分間インキュベー
トします。
- パパインインキュベーション中に、完全な蛍光培地溶液を調製します。B27の1 mLアリコート、Glutamaxの0.5 mLアリコート、およびPen-Strepの0.5 mLアリコートを解凍します。.48.5 mLのHibernateA低蛍光培地を50 mLのコニカルチューブに分注します。.B27、グルタマックス、ペン連鎖球菌を溶液に加えます。溶液をよく振ってから、ろ過滅菌し、「Hibernate A complete media」(日付とイニシャル付き)とラベル付けします。37°Cの水浴中でインキュベートします。
- パパインインキュベーション後、パパインチューブと滅菌BSAチューブをフローキャビネットに移します。1 mLパスツールピペットを使用して、パパインチューブから皮質海馬組織のみをBSAチューブ1.
に取り出します。
手記：余分なパパイン溶液の移動を最小限に抑えるように注意してください。.
- 細胞の解離
- 組織の大きな塊をバラバラにするために、1 mLのパスツールピペットを使用して組織を数回粉砕します。これに続いて、細いパスツールピペットを使用してティッシュを7回粉砕します。ティッシュを30秒間放置し、より大きなティッシュ片を沈殿させます。
- 30秒後、下部1 mLの溶液と組織をBSAチューブ1からBSAチューブ2に移します。細いパスツールピペットを使用して、BSAチューブ2内の組織を数回粉砕します。
- トリチュレーション後、下部の1 mLの組織と溶液をBSAチューブ1から再度移しますが、今度はBSAチューブ3に移します。細いパスツールピペットを使用して、BSAチューブ内の組織を3回数回粉砕します。
- トリチュレーション後、チューブ2および3のすべての溶液と組織をBSAチューブ1に移します。さらに2〜3回回転させ、3,000 x gで3分間遠心分離します。
- 遠心分離中に、完全な神経基礎A培地(NBA培地)を調製します。48.5 mLのNBA培地を50 mLのコニカルチューブに分注し、37°Cのウォーターバスでインキュベートします。このチューブに「NBAのみ」のラベルを付けます。さらに、B27の1 mLアリコート、Glutamaxの0.5 mLアリコート、およびPen-Strepの0.5 mLアリコートを室温で解凍します。.
- 遠心分離後、ペレット化した組織から上清を慎重に取り除き、細胞を2 mLの完全培地に再懸濁します。P1000ピペットを使用して、組織を20回上下に粉砕します><。
手記：細胞を激しくピペットで動かさないように注意してください。圧力がかかりすぎると、細胞が損傷する可能性があります。
- 1 mLパスツールピペットを使用して、細胞懸濁液を30 μmの細胞ふるいでポリスチレンサンプルチューブにろ過します><。
手記： 細胞懸濁液が細胞ふるいをすぐに通過しない場合は、滅菌手袋でふるいの上部を押して流れを開始する必要がある場合があります。この重要なステップは、セルソーターの目詰まりを防ぎます。
- ソーティング後にニューロンを採取するには、300 μLの完全培地を必要な数のポリプロピレンチューブにピペッティングして、採取チューブを調製します。
- これで、細胞懸濁液をセルソーターに持ち込んでソーティングする準備が整いました。細胞懸濁液、追加の収集チューブ、およびサンプルの希釈が必要な場合に備えて完全な培地を予備として取ります。
3. 精製されたGABA作動性またはグルタミン酸作動性ニューロンの細胞選別
>注:選別中の細菌汚染の可能性を最小限に抑えるために、選別する前に少なくとも5分間、選別機のサンプルチューブを70%エタノールですすいでください。詳細な選別パラメータは機器によって異なりますが、基本的な考慮事項は次のとおりです。
- 最初の細胞ソーティングでは、野生型動物の細胞を選別して比較することにより、標識されていない細胞のバックグラウンド蛍光レベルを確立します。
- ソーティングする蛍光細胞の種類ごとに、適切な励起フィルターと蛍光フィルターを選択します。Venusタンパク質とTdTomatoタンパク質をそれぞれ488 nmまたは531 nmの励起波長を使用して励起します。530/40および575/30の発光フィルターセットを通じて放出された光を検出します。
- 300 μLの完全培地を含むポリプロピレン製採取チューブをセルソーターに加え、細胞採取を行います。
- 高純度を得るには、明るく標識された蛍光細胞を選別します(選別された細胞のドットプロットなど、図1Bを参照)。
- 選別後、最適な結果を得るために、選別した細胞の純度試験を実施して純度レベルを推定します。ソーティング後の細胞の一般的な回収率は70〜80%であることに注意してください。
- 各収集チューブでソートされたセルの数を書き留めます。この値は、セルソーティング装置によって与えられます。
手記：細胞選別は、70 μmノズル(70 psiシース液圧)または100 μmノズル(20 psiシース液圧)を使用して実行できます。
4. 選別されたニューロンの培養
- 細胞選別後、1 mLパスツールピペットを使用して、収集した細胞を2 mLの丸底遠心チューブに移します。細胞を3,000 x gで3分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します
手記：細胞ペレットの位置を特定するには、丸底の遠心分離チューブを蓋のヒンジを外側に向けて向き、細胞ペレットが遠心分離チューブの背面(つまり、ヒンジと同じチューブの側)に形成されるようにします。
- 遠心分離中に、1 mLのB27、0.5 mLのGlutamax、0.5 mLのPen-Strepを、予熱したNBA培地48.5 mLに加えます。溶液をよく振ってから、ろ過滅菌し、「NBAコンプリートメディア」(日付とイニシャル付き)とラベル付けします。必要になるまでウォーターバスに戻します。
- 遠心分離後、1 mLのパスツールピペットを使用して、上清を別の遠心チューブに移します(細胞ペレットが乱された場合に備えて上清を保持します)。 細胞密度を1,000細胞/μLにするために、必要量の温めた完全NBA培地に細胞ペレットを再懸濁します。P200またはP1000ピペットでピペッティングして細胞を再懸濁します。
- 解離した細胞の存在を確認するには、4倍または10倍の対物レンズを使用して、顕微鏡で細胞溶液を確認します。あるいは、少量の細胞溶液をカバーガラスにピペットで移し、顕微鏡で観察します。多数の細胞が存在する場合は、ステップ4.3の上清を廃棄できます。
- セルをめっきする前に、中速で2〜3秒間ボルテックスして、セル懸濁液が均一になるようにします。ボルテックス後、細胞懸濁液10 μLを各カバースリップの中心まですばやくピペットで移します。細胞をピペッティングした後、各プレートをインキュベーター(5% CO2/37 °C)に素早く戻し、1時間
インキュベートします
手記：複数の24ウェルプレートに細胞を添加する場合は、プレート間で細胞をボルテックスして細胞密度を均一にします。
- 1時間後、予熱した完全NBA培地500μLを細胞に供給し、インキュベーターに戻します
手記：細胞に栄養を与えるときは、細胞の剥離を避けるために、培地をウェルの側面に優しくピペットで固定することが重要です。短時間(<16日)の場合、上記の密度での給餌は必要ありません。より高密度の細胞をプレーティングする場合、より頻繁な供給間隔が必要になる場合があります。
