無血清単層培養における胚性幹細胞からの神経前駆細胞の生成

要約

出典: Wongpaiboonwattana, W., et al. Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture. J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を生成するために無血清培地を使用するプロトコルを示しています。無血清培地に懸濁した所望の濃度の胚性幹細胞を、ゼラチンコーティングされたカバースリップに播種します。最適な細胞密度で、細胞は自己分泌シグナル伝達因子を産生し、無血清培地中の神経分化誘導因子とともに、胚性幹細胞の神経前駆細胞への分化を引き起こします。

プロトコル

1. メディアの準備

>注:このプロトコルは、2つの別々の培地の組み合わせを使用することに依存しています:DMEM/F12に改変N2サプリメントを添加し、NeurobasalにB27サプリメントを添加し、通常は1:1の比率で投与します。

1. 15 mLチューブで成分を混合して、修飾したN2サプリメントを調製します。これをボルテックスしたりフィルタリングしたりしないでください。溶液が透明になるまでチューブを反転させて混合します。
   1. まず、7.2 mLのDMEM/F12をピペッティングし、次に25 mg/mlのインスリン(0.01 M HClで構成)を1 mL加え、チューブを反転させてよく混合します。解決策が明確になるまで数分かかります。
   2. 100 mg/mLのアポトランスフェリン(水で調製)1 mL、0.6 mg/mLのプロゲステロン(エタノールで調製)33 μl、160 mg/mL(1 M)のプトレシン(水で調製)100 μl、3 mM亜セレン酸ナトリウム(水で調製)10 μL、7.5%ウシ血清アルブミン666 μLを加えて、チューブをよく混合します。2.5 mLに分注し、-20°Cで最大2か月間保存します。
2. メディアを準備します。
   1. 250 mlのDMEM / F12に2.5 mlのN2を加えます。.よく混ぜますが、振ったりろ過したりしないでください。
   2. 250 mlの神経基礎培地に、5 mlのB27サプリメントを追加します。.よく混ぜますが、振ったりろ過したりしないでください。
   3. 手順 1.2.1 と 1.2.2 のメディアを 1:1 の比率で混合します。場合によっては、1:3 のミックスが必要になることがあります (ステップ 1.2.4 の 1:1 ミックスとして補足されます)。
   4. L-グルタミン0.5ml(最終濃度0.2mM)と2-メルカプトエタノール3.5μl(最終濃度0.1mM)を加え、振とうせずによく混ぜ合わせます。メディアは4°Cで最大3週間保管し、光にさらさないようにしてください。この最終ミックスはN2B27と呼ばれます。
3. ゼラチン溶液を準備します。
   1. 1%ゼラチン溶液を超純水で調製し、121°C、15psiで15分間オートクレーブします。これに使用するボトルは、洗剤や消毒剤が完全にきれいであることが重要であるため、新しいボトルを使用して、使用の合間に超純水ですすぐことをお勧めします。1%溶液を50 mLのアリコートに分注し、4°Cで数か月間保持します。
   2. 1%ゼラチンのアリコートを37°Cのウォーターバスで溶解するまで温め、500mlの温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加えます。よく混ぜて、各ウェルまたはプレートの底を覆うのに十分なほどピペットで動かします。ゼラチンが表面を少なくとも30分間コーティングします。

2. セルのめっき

>注:このプロトコルは、白血病抑制因子(LIF)を含む10%血清で増殖したマウスESC、LIFによる血清置換、またはLIFおよび骨形態形成タンパク質4(BMP4)またはLIFの有無にかかわらずMEKおよびGSK3阻害剤(2i培地)を含む無血清培地に等しく適用されます。ただし、分化のタイミングと効率は、培地や細胞によって異なる場合があります。ここに示す実験では、10%の血清とLIFを含むGMEMで増殖した46CマウスESCライン(EGFPレポーターを内因性Sox1対立遺伝子の1つにノックイン)を使用しました。最適な結果を得るには、細胞を解離し、N2B27培地で再播種することが重要です。単に培地をGMEM/血清/LIFからN2B27に変更するだけで、細胞を再プレーティングする場合と比較して、常に分化効率が低下します。

1. 10%血清、1 mMピルビン酸ナトリウム、1x非必須アミノ酸、0.1 M 2-メルカプトエタノール、および100ユニット/ mlLIF13を使用してGMEMで細胞を増殖させます。マウスESCのサブコンフルエント培養を行うには、1 x 10⁶細胞をT25培養フラスコにプレートし、2〜3日かかります。
2. 明視野顕微鏡で細胞を観察します。細胞がサブコンフルエントになり、継代の準備ができたら、PBSで2回すすぎます。細胞解離試薬1 mLを加え、インキュベーターに2〜5分間戻します。トリプシンなどの酵素も細胞の解離に利用することができますが、細胞の接着に悪影響を及ぼす可能性があるため、めっき濃度の調整が必要になります。
3. 細胞がプレートから浮き上がり始めたら、容器を軽くたたいて細胞を単細胞懸濁液に取り除きます。細胞を10 mLの培地と細胞解離試薬に集め、15 mLの遠心チューブにピペットで移します。
4. 細胞を300 x gでRTで3分間回転させます。
5. 上清を慎重に吸引し、3〜5回ピペッティングして、10mlの予熱したN2B27にペレットを再懸濁します。懸濁液をピペッティングする際は、気泡が発生しないようにチューブの側面にピペッティングしてください。自動セルカウンターまたは血球計算盤で細胞をカウントし、濃度を記録します。
6. 予熱したN2B27にウェルごとにプレーティングする単位体積当たりの所望の細胞数を含む細胞懸濁液を調製する。6ウェルディッシュ中の^1cm2あたり10,500細胞の密度(すなわち、6ウェルディッシュのウェルあたり1 x 10⁵細胞)が最適です。さまざまな細胞培養容器の推奨細胞数/cm²およびプレーティング培地の量については、表1を参照してください。
7. 培養容器からゼラチンを吸引し、表1の推奨密度と容量に従って細胞懸濁液をプレート化します。プレートを渦巻かせると、細胞が中心に集中するため、プレートを回転させないでください。培養物を37°C、5%CO₂の湿度の高いインキュベーターに入れます。
8. 1〜2日ごとにメディアを交換し、すべてのメディアを新しいN2B27と交換します。細胞を洗い流すと密度に影響を与え、翌日の分化効率が低下する可能性があるため、ピペットでやさしくピペットします。プレーティング後の初期生存率が低い場合は、N2とB27を添加した培地を1:3に混合した細胞に播種し、最初の2日後にこれをN2B27に変更します。細胞は分化を開始し、4〜6日以内にSox1の発現を示すはずです(ここで使用した46C細胞株のレポーターの緑色蛍光で確認可能)。

>表 1.さまざまな容器サイズに推奨されるめっき密度と培地量。この表のめっき密度は、46C細胞株を使用して決定しました。最適な結果を得るには、個々のラインのめっき密度を調整する必要がある場合があります。

名 名 名 名 名 名

プラットホーム	有効密度の範囲(細胞数/cm2)	プレートへのセル番号の範囲	推奨初期培地容量(μl)	1日目以降の推奨培地量(μl)
6ウェルプレート	10,500 - 36,500	99,750 - 346,750	1,000	2,000
24ウェルプレート	15,600〜46,800	29,640〜88,920	500	1,000
96ウェルプレート	103,500 - 260,000	33,120〜83,200	100	200

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ胎児血清	ライフテクノロジー	10270-106
DMEM/F12	ライフテクノロジー	11320-074
神経基礎媒体	ライフテクノロジー	21103-049
StemPro Accutase 細胞解離試薬	ライフテクノロジー	A11105-01
B-27サプリメント、無血清	ライフテクノロジー	17504-044
インスリン	シグマ	I6634	滅菌済み0.01M HClで再構成
アポトランスフェリン	シグマ	T1147	滅菌水で再構成します
プロゲステロン	シグマ	P8783	エタノールで再構成
プトレシン	シグマ	P5780	滅菌水で再構成します
亜セレン酸ナトリウム	シグマ	S5261	滅菌水で再構成します
ウシアルブミン画分V	ライフテクノロジー	15260-037
L-グルタミン	ライフテクノロジー	〒25030-081	グルタミンは通常沈殿するため、使用前に完全に溶解していることを確認してください
ゼラチン	シグマ	G1890
6ウェル組織培養皿	サーモサイエンティフィック	140675
24ウェル組織培養皿	サーモサイエンティフィック	142475
96ウェル組織培養ディッシュ	サーモサイエンティフィック	167008
GMEM	ライフテクノロジー	11710-035
ウシ胎児血清	ライフテクノロジー	10270-106
MEM非必須アミノ酸溶液	ライフテクノロジー	11140-050
ピルビン酸ナトリウム	ライフテクノロジー	11360-070
2-メルカプトエタノール	シグマ	M7522
25cm2組織培養フラスコ	サーモサイエンティフィック	156367

の 型 型 型 の