多孔質足場を用いたヒト神経幹細胞の3D培養への分化

要約

出典: Stevanato, L. et al., Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、3次元の足場内でのヒト神経幹細胞の発生と分化を示しています。足場上のラミニンコーティングは細胞の接着を促進し、成長因子を含まない神経培地は細胞分化を誘導し、神経前駆細胞は多孔質構造内でプロセスを多方向に拡張して三次元培養を形成します

プロトコル

>1. 3次元(3D)カルチャーにおけるHNSCの分化

>注:以前の出版物に記載されている倫理的に承認された組織からヒト神経幹細胞(hNSC)を分離し、誘導します。この手順に従いながら、倫理的および制度的なガイドラインに従ってください。

1. 12ウェルプレートを用いた3D培養
   1. 手順全体を通して無菌技術を使用します。生物学的安全キャビネットで、灌漑用水(WFIr)を使用して調製した2 ml /ウェルの70%エタノールを追加して、足場を再水和します。足場に触れないように、70%エタノールを各ウェルの壁に分注します。
   2. 70%エタノールを慎重に吸引し、すぐに2 ml /ウェルのダルベッコのモディファイドイーグルミディアムF12(DMEM:F12)で足場を1分間洗浄します。DMEM:F12を最終洗浄後に慎重に吸引します。
   3. 2 ml/ウェルのラミニン(10 μg/ml)をDMEM:F12に添加して、足場をコーティングします。プレートを5% CO₂加湿インキュベーターで37°Cで最低2時間インキュベートします。温かいDMEM:F12でプレートを洗います。
   4. 各スキャフォールドに、150 μlのRMM+成長因子(GF)に約500,000個のhNSCを播種します。
   5. プレートを5% CO₂加湿インキュベーターで37°Cで3時間インキュベートし、細胞が足場に落ち着くようにします。
   6. 各ウェルに3.5 mLのRMMを添加し、足場から細胞が外れないように注意します。
   7. プレートを7日間インキュベートし、RMM培地(3.5 mL/ウェル)を1日後(初回給餌)後、および初回給餌から2〜3日後に再度交換します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM:F12	インビトゲン	〒21331-020	RMM培地調製用
ヒトアルブミン溶液	バクスターヘルスケアリミテッド	1501052	RMM 培地の場合、最終濃度 0.03% で使用
トランスフェリン、ヒト組換え体	シグマ	T8158	RMM培地の場合、最終濃度5μg/mlで使用
プトレシンDiHCl	シグマ	P5780	RMM培地の場合、最終濃度16.2 μg/mLで使用
インスリン、ヒト組換え体	シグマ	I9278	RMM培地の場合、最終濃度5μg/mlで使用
プロゲステロン	シグマ	P6149	RMM培地の場合、最終濃度60 ng/mlで使用
L-グルタミン	インビトゲン	25030-24	RMM 培地の場合、最終濃度 2 mM で使用
亜セレン酸ナトリウム	シグマ	S9133	RMM培地の場合、最終濃度40 ng/mLで使用
bFGFの	ペプロテック	AF-100-15	RMM培地に添加し、最終濃度10 ng/mLで使用
EGFの	ペプロテック	AF-100-188	RMM培地に添加し、最終濃度20 ng/mLで使用
4-OHTの	シグマ	H7904-J	RMM培地に添加し、最終濃度100 nMで使用
ラミニン	AMSバイオテクノロジー	〒3400-010-10
灌漑用水	バクスターヘルスケア	UKF7114
Alvetex 12ウェルプレート	Reinnervate株式会社	AVP002
エタノール	メルク	1.00986.1000