$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ディッシュコーティング、培地調製、hPSCメンテナンスのセットアップ
- ディッシュコーティング
- ビトロネクチン(VTN)コーティング
- VTNのバイアルを37°Cのウォーターバスに完全に解凍するまで置き、完全に混合します。
- 100 mmシャーレの場合、1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)7 mLを0.5 mg/mL VTNと混合し、ディッシュにVTN溶液を加え、室温(RT)で1時間インキュベー
トします。
- 基底膜マトリックスコーティング
- 基底膜マトリックスのバイアル(材料表を参照)を氷上で4°Cで一晩解凍します。
- 6ウェルプレートの1ウェルに、2 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)を20 μLの100倍基底膜マトリックスと混合し、基底膜マトリックス溶液を皿に加え、皿をパラフィンフィルムで包み、4°Cの清潔な容器に一晩保存します。できるだけ早く作業します。コーティングされた皿は、4°Cで最大2週間保存できます。
- ポリオルニチン(PO)/ラミニン(LM)/フィブロネクチン(FN)コーティング
- 初日は、24ウェルプレートの1ウェルについて、15 μg/mLのPOと1 mLの1x PBSを混合し、37°C、5% CO2で一晩インキュベートします。LMとFNの両方を-20°Cで一晩解凍し、完全に解凍するまで4°Cで保存します。
- 2日目に、PO溶液を吸引し、ウェルを1x PBSで2回洗浄し、2 μg/mLのLMと2 μg/mLのFNを含む1x PBSを1 mL加え、5% CO2で37°Cで一晩インキュベートします。この時点で、LM/FN溶液の入った皿は、乾燥しない限り、数ヶ月間インキュベーターに保管することができます。皿が乾くのを防ぐために、1x PBSを追加します。
- メディアの準備
- エッセンシャル8ミディアム(E8)は、E8サプリメント1本を4°Cで一晩解凍して調製します。必要に応じて、サプリメントを500 mLのE8培地と抗生物質と混合します
手記：動作するE8溶液は、2週間以内に使い切る必要があります。
- hPSC 凍結培地を調製するには、90 mL の完全 E8 培地と 10 mL のジメチルスルホキシド(DMSO)を混合して、総容量 100 mL にします。フィルター滅菌します。
- 100 mLの必須6(E6)培地を10 μM SB431542、1 ng/mLの骨形成タンパク質4(BMP4)、300 nM CHIR99021、および10 μM Y27632を混合して、合計容量100 mLになるように、0日目から1日目の分化培地を準備します。
- 2日目から10日目までの分化培地を、100 mLのE6培地を10 μM SBおよび0.75 μM CHIR99021と混合して、総容量100 mLにします。
- 神経基礎培地を 2 mL の B27 (50x)、1 mL の N2 (100x)、2 mM L-グルタミン酸、3 μM CHIR99021、および 10 ng/mL の線維芽細胞成長因子-2 (FGF2) と混合して、総容量 100 mL の 10 日目から 14 日目のスフェロイド培地を調製します。
- 14日目から28日目までの培地をスフェロイド長期維持のために、10日目から14日目までのスフェロイド培地に0.5μMの新鮮なレチノイン酸(RA)を添加し、給餌ごとに調製します。
手記：RAは常に-80°Cに保ってください。
- 神経基礎培地を2 mLのB27(50倍)、1 mLのN2(100倍)、2 mM L-グルタミン酸、25 ng/mLグリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、25 ng/mL脳由来神経栄養因子(BDNF)、25 ng/mL神経成長因子(NGF)、200 μMアスコルビン酸、および0.2 mMジブチリル環状アデノシン一リン酸(dbcAMP)と混合して、総容量100 mLになるようにSymN成熟培地を調製します。溶液は2週間以内に使用する必要があります。各給餌の前に、0.125 μMの新鮮なRAを添加してください。このソリューションは、14日目(オプション1)または28日目(オプション2)から使用されます。
- 蛍光活性化セルソーティング(FACS)バッファーを調製するには、DMEMを2% FBS、2 mM L-グルタミン酸、および必要に応じて抗生物質と混合し、総容量100 mLにします。
- hPSCメンテナンス
- hPSCの解凍と保持
- VTNコーティングされた100mmディッシュを1枚用意します。
- 液体窒素から直接hPSCのバイアルを解凍するには、バイアルを37°Cのウォーターバスに入れ、チューブを水で慎重に振って解凍します。解凍したhPSCを10 mLの1x PBSが入った15 mLチューブに移し、200 x gで4分間遠心分離します。
- 上清を捨て、チューブに1 mLのE8培地を加えます。数回ピペットでペレットを完全に再懸濁し、さらに9 mLのE8培地を加えて合計10 mLにします。
- 100mmディッシュからVTN溶液を吸引します。
- hPSCを100 mmディッシュに移し、軽く振って(円ではなく、上下左右に)、細胞がディッシュ内に均一に分布していることを確認します
- 37°Cで5%CO2中でインキュベートします。
- 翌日、すべての培地を吸引し、10 mLのE8で給餌します。
- 次の3〜4日間、毎日この方法で給餌し、その後、分割する準備をします。
- hPSCsの分割
注:分裂点のhPSCは、80%〜90%のコンフルエントである必要があります。滑らかで明るいエッジを持つ大きなコロニーを観察する必要があります。ただし、各コロニー間の接触は避けるべきです(図1B、0日目および図4B)。
- 必要に応じて、VTNコーティングされた100mmの皿を準備します。
- E8を吸引し、1xPBSで1x分割する必要がある皿を洗います。
- 1x PBSを吸引し、0.25 M EDTAを4 mL加えます。37 °C、5% CO2.
で 2 分間インキュベートします。
手記：hPSCは、小さなコロニーとして分割/再播種する必要があります。エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で2分以上処理しないで、単一細胞への分離を防ぎます。細胞は、2分間の処理後も皿の表面に付着している必要があります。
- EDTAを吸引し、10 mLのE8培地を皿の表面に強力にピペッティングしてコロニーを剥離し、すべての培地と細胞を15 mLのチューブに集めます。
- hPSCが80%〜90%のコンフルエント度の場合、コロニーを1:15〜1:20に分割します。例えば、hPSCを1:20で100 mmのディッシュ1つに分割するには、500 μLのE8/hPSC溶液を取り、9.5 mLの新鮮なE8培地と混合します。
- VTNコーティングされた100mm皿のhPSCのプレート.
手記：各研究者と細胞株の理想的な分割比を独立して設定することをお勧めします。
- hPSCの凍結
- 100 mmのhPSCディッシュ1枚につき、分割可能な状態で、3つのクライオバイアルと3.5 mLの凍結培地を準備します><。
注:培地とバイアルは、使用するまで4°Cまたは氷上に保管する必要があります。
- E8を吸引し、皿を1xPBSで2回洗います。
- 1x PBSを吸引し、0.25 M EDTAを4 mL加え、37°Cで2分間インキュベートし、5% CO2.
注:hPSCは、分割される時点で小さなコロニーとして凍結する必要があります。単一細胞への分離を防ぐために、細胞をEDTAで2分以上処理しないでください。細胞は、2分間の処理後も皿の表面に付着しているはずです。
- EDTAを吸引し、皿の表面に10 mLの1x PBSを強力にピペッティングしてコロニーを分離し、すべての培地と細胞を50 mLのチューブに集めます。
- 1x PBSを20mL加え、200 x gで4分間遠心分離して、残りのEDTAを洗い流します。
- 上清を捨て、ペレットを3mLの凍結培地に再懸濁します。
- hPSCを3つのクライオバイアルにそれぞれ1 mLずつ均等に分配します。
- -80°Cで一晩、制御された冷凍ボックスまたは発泡スチロールサンドイッチで保存して温度低下を緩やかにしてから、液体窒素タンクに移して長期保存します。
2. hPSCsの播種による微分の開始(0日目)
>注:hPSCは、安定化された後(つまり、解凍後に2〜3倍に分割された)に分化の準備ができている必要があります。コロニーが健康で、滑らかで光沢のあるエッジがあり、分化が最小限であることを確認してください(図2B)。
- 必要に応じて、0日目の1日前に基底膜マトリックスコーティングディッシュ(24ウェルまたは6ウェルディッシュ)を準備します。差別化の開始時に料理をRTに持っていきます。
- 必要に応じて、日を0〜1の微分培地にします。
- コンフルエントからE8を吸引し、hPCSを分割する準備ができており、1x PBSで皿を2回洗浄します。
- 100 mmディッシュあたり7 mLの0.25 M EDTAを加え、37°C、5% CO2で15分間インキュベートします
手記：この時点で、EDTA処理は延長され、単一細胞に分散します。
- すべてのhPSCをピペットで取り出し(浮かせている必要があります)、50 mLチューブに移します。EDTA溶液と同量以上の1x PBSを添加して、EDTAを希釈します。
- 200 x gで4分間遠心分離します。
- 上清を捨て、Day 0–1分化培地を1 mL加え、ピペットで細胞を均質化します。続いて培地をさらに追加し、次に混合して細胞溶液を細胞を数えるのに理想的な濃度に希釈します。
手記： 細胞溶液を過度に希釈しないでください。100 mmディッシュ1枚の細胞を5 mLの培地で希釈して開始する必要があります。
- 自動セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞数をカウントします。
- 必要に応じて細胞溶液を希釈し、最終容量を少なくして125,000細胞/cm2にします(例:6ウェルディッシュの場合はウェルあたり2 mL、24ウェルディッシュの場合はウェルあたり500 μL)
手記：体積が少ないと、細胞がより早く付着します。
- コーティングされた皿から基底膜マトリックス溶液をすべて吸引し、細胞溶液をウェルにプレートします。
- 37°Cで5%CO2中でインキュベートします。
>3. 神経堤細胞の誘導(1日目から10日目、図1A)
- 1日目に、0〜1日目の分化培地(6ウェルディッシュの場合はウェルあたり3 mL、24ウェルディッシュの場合はウェルあたり1 mL)を細胞に供給します。
- 2日目に、2日目から10日目の分化培地(6ウェルディッシュの場合はウェルあたり3 mL、24ウェルディッシュの場合はウェル1 mL)を細胞に供給します。
- これ以降、細胞は10日目まで1日おきに給餌する必要があります（つまり、次の給餌日は4日目になります（
手記： 6日目以降、NCリッジが検出されるはずです(図1B)。分化が起こっているかどうかを確認するには、SOX10/AP2aに染色し、分化時間に沿ってマーカー遺伝子発現に使用できる、より小さなウェル(つまり、24ウェル)で並行分化培養を行うことをお勧めします(図1B、C)。
- セルを並べ替える場合は、セクション4に進みます。それ以外の場合は、セクション 5 に進みます。
4. 神経堤マーカーCD49Dの蛍光活性化細胞選別(FACS)とスフェロイド中のNC細胞凝集
>注:FACS選別の場合、サンプルは氷上に保ち、染色後選別するまで光にさらさないでください。
- セルがソートされている場合は、FACSバッファーを準備します。
- 10-14日目のスフェロイド培地を準備します。
- 10日目に培地を取り出し、PBS1倍で1回洗います。
- 解離溶液(材料表を参照)を、6ウェルディッシュの場合はウェルあたり2 mL、24ウェルディッシュの場合はウェルあたり1 mLで加え、37°C、5%CO2で20分間インキュベートします。
- すべてのhPSCをピペットで取り外し、50 mLチューブに移します。
- チューブの残りの部分をFACSバッファーで満たし、200 x gで4分間遠心分離します
手記：各50 mLチューブは、最大20 mL以下の細胞溶液を収容できます。FACSバッファーの容量は、解離溶液を中和するのに十分な量でなければなりません。
- 上清を廃棄し、適切な量のFACSバッファー(6ウェルプレートのウェルあたり~2 mL)で細胞を再懸濁し、カウントして細胞数を決定します。
- 次のサンプルを用意します。
- サンプル1(未染色コントロール):400μLのFACSバッファーに1 x 106細胞。20 μmのストレーナキャップで細胞をろ過し、チューブを氷上に保ちます。
- サンプル 2 (DAPI のみのコントロール): 0.5 ug/mL 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) を含む 400 μL の FACS バッファーに 1 x 106 細胞。ストレーナーキャップ付きのFACSチューブで細胞をろ過し、チューブを氷上に保ちます。
- サンプル3(CD49D標識):フィコエリスリン/シアニン7(PE/Cy7)標識CD49D抗体(FACSバッファー100μLあたり106細胞×1個で5μL)を含むFACSバッファーで残りの細胞を15mLチューブに懸濁し、氷上で20分間インキュベートします。
- チューブにFACSバッファーを充填し、200 x gで4分間遠心分離します。
- 上清を廃棄し、製造元の指示に従って、0.5 ug/mL DAPIを含む1 mLのFACS緩衝液に5〜10 x 106細胞ごとに再懸濁します。
- ストレーナーキャップでFACSチューブを通して細胞をろ過し、チューブを氷上に保ちます。
- 2mLのFACSバッファーを含むコレクションFACSチューブを調製します。
- DAPIとPE-Cy7を検出できるレーザーでFACSマシンを選別し、CD49D+集団を分離します。
- ソート後、ソートされたセルをカウントします。
- 選別したすべての細胞を遠心分離し、10〜14日目のスフェロイド培地で、培地500 μLあたり6細胞の最終濃度0.5 x 10まで再懸濁します。
- ウェルあたり0.5 x 106セルを超低接着24ウェルプレートにプレートします。
- 細胞を37°Cで5%CO2中でインキュベートします。
5. スフェロイド中のNC細胞の凝集
- FACSを使用してNC細胞を単離せず、代わりにNC細胞を直接スフェロイドに凝集する場合は、まずステップ4.2〜4.5で説明したように細胞を調製します。
- チューブの残りの部分に1x PBSを充填し、200 x gで4分間遠心分離します。
- 上清を捨て、適切な量の10-14日目のスフェロイド培地(例えば、6ウェルプレートの場合、ウェルあたり~2 mLの培地)で細胞を再懸濁し、カウントして細胞数を決定します。
- 10-14日目のスフェロイド培地で細胞を、培地500μLあたり0.5 x 106細胞に希釈します。
- 超低接着24ウェルプレートにウェルあたり500μLの細胞懸濁液をプレートします。
- 細胞を37°Cで5%CO2中でインキュベートします。
6. NC回転楕円体の維持と交感神経前駆細胞誘導(10日目から14日目、図3A)
- オプション 1:最小限のスフェロイド培養
- 11日目に、10日目から既存の培地を吸引せずに、10日目から14日目のスフェロイド培地500μLをNCスフェロイドに加えます。37°Cで5%CO2中でインキュベートします。
- 12日目に、プレートを傾けて、ウェルの片側にNCスフェロイドを蓄積します。できるだけ多くの培地を慎重に吸引して廃棄し、10〜14日目のスフェロイド培地1mLを給餌します。
- 14日目まで毎日細胞に栄養を与え続けます。
- オプション: スフェロイドが凝集して大きな塊を生成する場合は、ピペットを使用してスフェロイドの塊を分割します。これにより、個々のスフェロイドが大きくなりすぎないようにすることもできます。
手記：理想的なスフェロイドサイズの範囲は、約100〜500 μmです。その範囲内では、個々のスフェロイドのサイズは重要ではありません。ただし、滑らかで明確なエッジ(図2および図4)などの形態は、さらなる成功のために重要です。14日目には、各24ウェルプレートには、上記のサイズ範囲内の異なるサイズの約50〜60個のスフェロイドが理想的です。
- オプション 2:スフェロイド培養の拡大
- 15日目にNCスフェロイドを保持するために、0.5 μM RAを含む10-14日目のスフェロイド培地1.5 mLを給餌します。37°C、5%CO2.
でインキュベートします
手記： RAは、給餌のたびに新鮮に添加し、常に-80°Cで保存する必要があります。
- これからは、28日目まで隔日で給餌し、その後、回転楕円体のめっきを続けます(セクション7.1).
手記： 成長しているスフェロイドは、1mLのピペットでピペッティングして分解することにより、週に約1回分割されます。それらは約1:2〜1:4の比率で分割されます。2週間の拡大期間内に、細胞の数は約4倍になるはずです。
7. 交感神経細胞(SymN)の分化と成熟(オプション1:14日目以降;オプション2:28日目以降)
- 通常の料理にスフェロイドを盛り付ける
- PO/LM/FMコーティングされた24ウェルプレートを準備します。
- 0.125 μM RA(すべての飼料に新鮮なものを追加)と10 μM Y27632(14日目のみ)を含むsymN培地を調製します。
- 14日目に、プレートを傾けて、ウェルの片側にNCスフェロイドを蓄積します。できるだけ多くの培地を慎重に吸引して廃棄し、1 mLのsymN培地を給餌します。
- コーティングされたプレートからLM / FNを取り外します。
- 24ウェルプレートの各ウェルを分割し、新しいコーティングされた24ウェルプレートの4つの別々のウェルにプレートします。各オリジナルウェルには1mLがあり、~50〜60個のスフェロイドが含まれています。これにより、新しいプレート上の各ウェルに約10〜15個のスフェロイドを含む250μLが得られます。
- ウェルあたり250μLの追加培地を加えます.
手記： これは 1:4 の分割です。スフェロイドが溶液内に適切に分布し、分割が比較的均一になるようにします。スフェロイドの数は、最終的な数が symN の生成の成功に影響を与えないため、カウントされません。
- 37°C、5%CO2でインキュベートします。
- 15日目(またはオプション2の場合は29日目)に、すべての培地を0.125 μM RAを含む1 mLのsymN培地に置き換えて給餌します。今後、ニューロンは20日目(またはオプション2の場合は35日目)まで2日ごとに供給する必要があります。
- 20日目(またはオプション2の場合は35日目)以降、既存の培地の半分(500μL)のみを慎重に交換することにより、ニューロンに栄養を与える必要があります。これからは、培地がすぐに黄色に変わらない限り、毎週給餌してください。
- 希望する時点まで毎週給餌を続けてください.
注:symNは神経節様構造に凝集する傾向があり、培養皿から分離する傾向があります。これを防ぐために、半給餌と最小限の取り扱いをお勧めします。
