ゼブラフィッシュ神経幹細胞からの初代ニューロスフェアの生成と分化

要約

出典:Lopez-Ramirez, M. A. et al., Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres.J. Vis. Exp. (2016年度)

このビデオは、一次ニューロスフェアの生成と分化を示しています。ゼブラフィッシュの神経幹細胞は、成長因子の存在下で、自己複製能力を持つ浮遊神経球に増殖し、その後、グリア細胞やニューロンに分化します。

プロトコル

1. 事前準備

1. 10 mLの解剖用培地を調製し、100x ペニシリン-ストレプトマイシン200 μlを9.8 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12) に加えます。
2. L-システイン溶液を調製する:組織培養用の水10mlに、L-システイン120mgを加える。L-システイン溶液は、4°Cで最大2週間、または-20°Cのアリコートで最大1年間保存します。
3. DNase I溶液を調製する:組織培養用の水1 mLにDNase I10 mgを加え、DNase I溶液を4°Cで最大2ヶ月間保存します。
4. パパイン溶液の調製:パパイン溶液を調製するには、100 μLのパパイン(約140単位)、100 μLのDNase I(1%)、および200 μlのL-システイン(12 mg/mL)を5 mLのDMEM/F12に加えます。パパイン溶液を毎回新たに調製し、0.22μmの孔径フィルターで滅菌してから使用してください。
5. 洗浄液の調製:100 mLの洗浄液を調製するには、650 μLのグルコース45%、500 μL 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、HEPES 1 Mおよび5 mlのウシ胎児血清(FBS)を93.85 mlのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)1xに加えます。使用前に0.22 μmの細孔サイズフィルターで洗浄液を滅菌します。洗浄液は4°Cで最大2ヶ月間保存してください。
6. インスリン溶液の調製:2 mLのインスリン溶液を調製するには、25 μlの滴10 N水酸化ナトリウム(NaOH)と100 mgのインスリンを組織培養用の水2 mLに加えます。
7. 上皮成長因子(EGF)および線維芽細胞成長因子(FGF)溶液を調製する:両方のマイトジェンをDMEM/F12に100μg/mlの濃度で溶解します。10 μlアリコートとして-20°Cで保存してください。
8. B-27およびN-2培地を調製する:B-27およびN-2サプリメントを-20°Cでそれぞれ500μlおよび1mlのアリコートとして保存します。
9. Z分化条件培地を調製する:Z分化条件培地100 mLを調製するには、インスリン40 μl (50 mg/ml)、B-27 500 μl、N-2 1 ml、N-2 1 ml、グルコース45%650 μL、100 x ペニシリン-ストレプトマイシン1 mLを97.81 mLのDMEM/F12に加えます。使用前に、Z分化条件培地を0.22 μmの細孔径フィルターで滅菌してください。Z分化条件培地を4°Cで最大1週間保存してください。
10. Zコンディション培地を調製する:50 mLのZコンディション培地を調製するには、50 mLの滅菌Z分化条件培地(20 ng/mL)に10 μlのEGFと10 μlのFGFを加えます。Zコンディショニング培地は、4°Cで最大1週間保存してください。
11. 分化培養用のコーティング液を調製する:5 mLの細胞外コーティング液の場合、4.9 mLのDMEM/F12に100 μlの細胞外マトリックス溶液(Matrigelなど)を加えます。細胞外マトリックス溶液を氷上で4°Cで解凍します。解凍後、4°Cで最大2週間保管します。

2. ゼブラフィッシュの成体脳の解剖

1. 100 mm x 15 mmのペトリ皿にジェルアイスパックを充填して、解剖ベッドを準備します。次に、蓋をシャーレに置き、ゲルが凍結するまで-20°Cでインキュベートします。蓋の上にきれいな濾紙の正方形を置き、濾紙とペトリ皿の両方をプラスチックフィルムで包みます。
2. すべてのマイクロダイセクション機器は、使用前に毎回70%エタノールまたは熱で洗浄および滅菌してください。滅菌したすべての解剖器具を解剖顕微鏡の近くに置き、安楽死の直前に、解剖床を光ファイバー照明付きの顕微鏡の下に置きます。
3. 2匹の成魚を採取して全脳神経球を調製し、3〜4匹のゼブラフィッシュを採取して解剖した脳領域からニューロスフェアを作製します。
4. 成体のゼブラフィッシュ(生後8〜12か月)を、施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコルを使用して安楽死させます。次に、魚を75%エタノールに5〜10秒間浸し、解剖ベッドにすばやく置き、続いて外科用ブレードを使用して鰓のレベルで斬首します。
   1. 動物を安楽死させるには、動物の心拍が徐々に遅くなり、循環が止まるまでトリカインメタンスルホン酸の過剰摂取(300 mg / L)を投与し、その後、氷水に浸します。
5. 頭の背側を下にして、ハサミで切り口から縦に切り込みを入れます。鉗子を使用すると、頭蓋骨の基部が露出し、隣接するすべての組織が除去されます。頭蓋骨の側壁を脊髄の始まりから蓋に向かって切り取ります。
6. ハサミを使用して、視神経を切断して取り除き、次に蓋蓋骨のレベルで頭蓋骨の最も外側の部分の両側を取り除きます。頭の腹側を上に向けます。鉗子を使用して、頭蓋骨の最も先端部分の残りの部分をはがします。
7. 頭蓋骨の残りの部分とともに脳を解剖培地(1.1)を備えた新しい皿に移します。マイクロナイフのプラスチック製のハンドルを使用して、解剖液中の脳組織を洗浄し、すべての脳構造を無傷に保ちます。
8. この時点から、ゼブラフィッシュの脳全体を使用してプロトコルを続けます。
   1. あるいは、このプロトコルを特定の脳領域に適合させて、ゼブラフィッシュの脳全体から、または新鮮なメスで解剖した終脳、蓋骨/間脳、または小脳からニューロスフェアを生成します。図1に示すように、神経特異的な蛍光ゼブラフィッシュ神経トランスジェニック系統を使用して、関心のある脳領域を解剖します。

3. 成体脳の単一細胞解離

1. その後のすべての作業は、生物学的安全キャビネットで行ってください。脳組織を、800 μlの解剖培地(ステップ1.1で調製)が入った1.5 mLチューブに移します。脳組織に触れずに、ピペッティングで解剖培地を取り出します。
2. 500 μlのパパイン溶液を加え (ステップ1.4)、脳組織を37°Cで10分間消化します。15分以上インキュベートすると、細胞の生存率が低下する可能性があるため、インキュベートしないでください。
3. インキュベーション後、底から~0.25インチにカットした1,000 μlのピペットチップを使用して、500 μlのパパイン溶液を含む脳組織を15 mLのコニカルチューブに移します。同じチップで10回ゆっくりとピペッティングして、脳組織を穏やかに解離します。このステップでは、ピペッティングを15回以上行ったり、気泡を発生させたりしないでください。これは、細胞の生存率を変化させる可能性があるためです。
4. 脳組織を再び37°Cで10分間インキュベートした後、ノーカットの1,000 μlのレギュラーチップを使用して10〜13回ピペッティングします。細胞死を避けるために、15回以上ピペッティングを上下させないでください。
5. 2 mLの洗浄液を加えて酵素消化を停止し(ステップ1.5)、細胞懸濁液を800 x gで室温(RT)で5分間遠心分離します。上清を慎重にデカントし、指でチューブを強くたたいたいてから、1,000 μlのレギュラーチップでピペッティングして、ペレットを残りの溶液に再懸濁します。次に、2mlの洗浄液を加えます。
6. この段階で、顕微鏡で単一細胞懸濁液が得られていることを確認します。細胞懸濁液を800 x gでRTで5分間再度遠心分離し、上清を除去し、1 mLの新鮮なZコンディショニング培地を使用してペレットを再懸濁します(ステップ1.10)。
7. トリパンブルーを使用して細胞を染色し、血球計算盤を使用して青色の死細胞を除外して生細胞をカウントします。各ウェルに200 μlの細胞懸濁液と300 μlの新鮮なZ条件培地を入れた24ウェルプレートを調製します。~500細胞/μlの密度で細胞を播種します。ゼブラフィッシュの脳由来ニューロスフェアは37°Cではうまく成長しないため、インキュベーター内の培養細胞を5%_CO2で30°Cに維持します。

>4. 一次ニューロスフェアの生成

1. in vitro(DiV1)で1日後、成体全脳から採取した単細胞懸濁液を顕微鏡で観察し、ウェルの中央に破片が蓄積していないか確認します。約100 μlの培地をピペッティングして、破片を慎重に取り除きます(可能であればそれを減らします)。次に、100 μlの新鮮なZコンディション培地を加えます。この時点で、シングルセル懸濁液を観察する必要があります(図2A、DiV1)。
2. in vitro(DiV2)で2日後、培養細胞を増殖させます。チップをカットした1,000 μLのピペットを使用して、各ウェルから250 μlの細胞懸濁液を回収し、新しいウェルに移します。250 μlの新鮮なZコンディション培地をすべてのウェルに加えます。培養細胞を増殖させる前に、ウェル全体でピペッティングして懸濁液を非常に穏やかにホモジナイズします。
3. ステップ4.1と4.2を次の4日間in vitro(DiV4)で繰り返します。ニューロスフェアのサイズの漸進的な増加は、DiV3およびDiV4のウェルの中央と端に見えるはずです（図2BおよびC）
   手記：初代ニューロスフェアは、多能性を評価するために、継代または分化のために処理することができます。あるいは、ヌクレオフェクションまたはリポトランスフェクションのために処理して、分化プロセス中の特定の遺伝子の役割を特徴づけることもできます。

5. プライマリーニューロスフィアの通過

1. 各ウェルから250 μlの組織培養物を取り出し、1 mLのピペットでDiV4ニューロスフェアを機械的に解離します。気泡の形成により細胞死が増加する可能性があるため、急いでピペを上下させないでください。
2. 血球計算盤で細胞をカウントし、250 μlの初代培養上清中の800細胞/μlを24ウェルプレートの各ウェルに分配します。
3. 各ウェルに250μlのZコンディション培地を添加します。
4. in vitro(DiV2)で2日後、ステップ4.2および4.3で報告したように培養細胞を増殖させます。

6. 一次ニューロスフィアの分化

1. カバーガラスを70%エタノールに10分間浸漬して滅菌し、次にRTでカバーガラスを12ウェルプレートの各ウェルに入れて乾燥させます。
2. カバーガラスの中央に300μlの細胞外コーティング溶液(ステップ1.11)を添加し、カバーガラス全体が広く広がるようにします。次に、37°Cで1時間インキュベートします(加湿細胞培養インキュベーターを使用)。
3. インキュベーション後、細胞外コーティング溶液を取り出し、カバーガラスを37°Cで2時間乾燥させます。
4. 各ウェルから250 μlの組織培養物を取り出します。1 mLのピペット(先端が幅の広い)で、ピペッティングを上下させて、ウェルあたりのすべてのDiV4一次ニューロスフェアを機械的に解離します。
5. 解離したニューロスフェア細胞懸濁液を、あらかじめ調製した細胞外マトリックスコーティングカバーガラス上に4×10³細胞/mlの細胞密度で播種し(ステップ6.1-6.3)、基質に付着するまで、5%_CO2中で30°Cで少なくとも30分間保持します。次に、培地を取り出し、予め温めた新鮮なZ分化条件培地1 mLを急速に加え(ステップ1.9)、細胞を30°Cで24時間培養します。
6. 2日ごとに、細胞分化時にZ分化条件培地の半分を交換します。

結果

図1:ゼブラフィッシュの脳由来ニューロスフェアの分化。(A-C, E) Z分化培地で1日(A, DiVd1)、3日(B、DiVd3)、4日(CおよびD、DiVd4)に培養した全脳由来ニューロスフェアの位相差画像。(E) 生後12ヶ月のTg(GFAP:DsRed)ゼブラフィッシュの全脳の背側図。図のように、終脳(Tel)、tectum(Tec)、および小脳(Cer)を解剖し、収集しました。(D)通路0(P0)、1(P1)、および2(P2)の蓋、終脳、小脳から得られたDiVd4ニューロスフェアの画像...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DPBSの1X	ライフテクノロジー	14190-144
DMEM/F12 1X	ライフテクノロジー	11330-032
L-システイン塩酸塩一水和物	シグマ	C6852-25グラム
B-27	ライフテクノロジー	17504-044
N-2	ライフテクノロジー	17502-048	N-2サプリメント(100x)液
ヘープス	ライフテクノロジー	15630	1メートル
D-(+)-グルコース 45%	シグマ	G8769
ペニシリン-ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	15140-122
ウシ胎児血清	ライフテクノロジー	16000044
ヒトFGF-basic	ペプロテック	100-18B
ヒトEGF	ペプロテック	AF-100-15
インスリン	シグマ	I5500-50ミリグラム
DNAse	シグマ	DN25-10ミリグラム
パパイン	ワージントン・バイオケミカル・コーポレーション	LS003126
マトリゲル	ベクトン・ディキンソン	356234
PFAの	TCIの	P0018
PBSの	アメリカンバイオ	AB11072-04000
トリカインMS-222	シグマ	A5040 (英語)	4 mg / mlのストック溶液。
トライコールドジェル	シグマ	TGP8	ゲルパック
トリパンブルーステイン	ライフテクノロジー	15250061