サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 脳オルガノイドの生成(23日間)
- 神経外胚葉の開始(5日間)
注:鑑定を開始する前に、以下の点を考慮する必要があります。ヒトiPS細胞を得るためのリプログラミング法(レンチビラール、センダイウイルス、エピソーム、マイクロRNAベースなど)は、すべての患者および制御iPS細胞系統で同じであることが理想的です。公開されたプロトコルに基づくさまざまなリプログラミングキットと指示が利用可能です。ヒトiPS細胞の品質は、最適な分化を達成するための鍵となります。顕微鏡でコロニーと細胞の形態をモニターし、Oct3/4、Nanog、TRA-1-60などのマーカーの発現を試験することで多能性を検証します。
- フィーダーフリー条件下で、Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)マトリックスをコーティングした皿上で培地AでヒトiPS細胞を培養します.
手記：ヒトiPS細胞をフィーダーフリーおよび無血清で増殖させることで、定義された培養条件を維持し、分化開始前にマウス胚フィーダー細胞(MEF)を除去するための追加ステップを回避できます。ヒトiPS細胞が分化を開始するための最適な通過回数は、リプログラミング時の通過15から合計で70の通過までの範囲です。継代時には、機械的ストレスの少ない適切な細胞剥離溶液と2mLの血清ピペットを使用して、細胞凝集体としてhiPSCコロニーを分離し、凝集体を新しいディッシュに移します。単一細胞への解離は、ほとんどのiPS細胞株で分化とアポトーシスを誘導する可能性があるため、避けてください。また、シングルセルの長期継代により、ヒトiPS細胞のゲノム変化が増加する可能性があることが報告されています。細胞剥離法は、分離液を除去するために遠心分離ステップを必要とするため、iPS細胞の全体的な生存率を低下させるため、避けてください。すべての培養物、特にマイコプラズマの微生物汚染について定期的に試験してください。これは、iPS細胞の品質や分化能力が変化する可能性があるためです。
- 製造元の指示に従って、60 mmの組織培養皿にEHSマトリックスをコーティングします。
- 1 x 106 ヒト iPSC のアリコートを解凍します。EHSマトリックスでコーティングし、5 mLの培地Aを含む60 mmの組織培養皿にiPS細胞を播種します(材料表を参照)。培地を毎日交換し、細胞が~80%の密度に達した5〜7日後に継代します.
手記：融解したiPS細胞を、酵素を含まないコロニーの分離などの標準的な方法を用いて、少なくとも1回は分化させる前に、80%の密度で通過させます。簡単に言うと、iPS細胞培地を取り出し、あらかじめ温めた37°CのDulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12)で細胞を一度洗浄し、試薬Aを使用してメーカーの指示に従ってiPS細胞をインキュベートします(材料表を参照)。単一細胞への解離を避けるために、推奨されるインキュベーション時間を超えないようにしてください。ヒトiPS細胞は、単一細胞としてではなく、凝集体として分離して浮遊させる必要があります。その後、新しいEHSマトリックスコーティングディッシュに移すことができます。例えば、1つの60mmディッシュから取り出したiPSC凝集体を、新たに4つの60mmディッシュに分配することができます
b.メーカーの指示に従って、マイコプラズマ検出キットでマイコプラズマを確認してください。マイコプラズマはiPS細胞の分化能力を変化させる可能性があるため、マイコプラズマフリーのiPS細胞のみを使用してください。
- iPSC(80%コンフルエント)を解離し、試薬Bを使用してシングルセル懸濁液を調製します
- iPSCをあらかじめ温めた(37°C)DMEM/F12で一度洗浄します。
- 予熱した試薬B(例:60 mmディッシュに1 mL)を加え、iPS細胞を37°Cおよび5%CO2で5分間インキュベートします。
- ディッシュの側面と底面を指先で20回フリックして、iPS細胞を取り外してください。顕微鏡下で細胞の剥離を確認します。
- 1 mLマイクロピペットで、細胞懸濁液を皿内で5回上下にピペットで動かします。
- 培地Aを3 mL加えて試薬B1 mLを希釈し、細胞懸濁液を15 mLの遠心チューブに集めます。
- iPSC(500 x g)を室温で4分間静かにスピンダウンします。
- 細胞ペレットを1mLの培地Bに再懸濁し、血球計算盤で細胞数をカウントします><。
手記： 再懸濁には媒体Bのみを使用することに注意してください。培地Aは高濃度のbFGFを含んでおり、分化を阻害する可能性があるため、使用は避けてください。
- 細胞懸濁液を10 μM rho関連プロテインキナーゼ阻害剤(Y-27632)を添加した培地Bで、細胞懸濁液を4.5 x 105細胞/mLに希釈します。
- 非接着性のV底96ウェルプレートにウェルあたり100 μLを添加します><。
手記： 100 μLの部分を取り出す前に、毎回チューブを振って、細胞が懸濁液中に均等に分布していることを確認してください。サイズと形状が均質なニューロスフェア(丸く定義された表面)を得るためには、各ウェルに同等の細胞番号が含まれていることが重要です。
- 細胞を入れたプレートを500 x g、室温で3分間静かにスピンダウンし、37°Cおよび5%CO2でインキュベー
トします。
- 50 μLを取り出し、次の5日間、各ウェルに50 μLの新鮮な培地Bを加えて、毎日培地を交換します。
2. EHSマトリックスへのニューロスフィアの埋め込み(4日間)
- DMEM/F12とメディウムCの1:1混合物(v / v)、1:200(v / v)サプリメント1、1:100(v / v)サプリメント2(ビタミンAなし)、1:100 L-グルタミン、0.05 mM非必須アミノ酸(MEM)、100 U / mLペニシリン、100 μg / mLストレプトマイシン、1.6 g / Lインスリン、および0.05 mM β-メルカプトエタノール。
- 滅菌ハサミで事前に切断した~2 mmの先端を使用して、200 μLマイクロピペットでニューロスフェアを収集します。
- 空の100 mm皿のパラフィンフィルム(3 x 3 cm2)上にニューロスフィアを互いに約5 mm離して置き、残りの培地をできるだけ慎重に取り除きます。
- EHSマトリックスを1滴(7 μL)各ニューロスフェアに加えます。
- EHSマトリックスドロップをニューロスフェアとインキュベーターで15分間インキュベートします。
- ニューロスフェアをパラフィンフィルムからニューロスフェア培地で洗い流して慎重に洗い流します。フラッシュするには、1 mLマイクロピペットと、10 mLのニューロスフェア培地が入った新しい100 mmシャーレを使用します。
- ニューロスフィアを次の4日間インキュベートし、2日目に2mLの新鮮なニューロスフェア培地を追加します
手記： インキュベーターの棚が平らになっていることを確認して、EHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアが皿の片側に固まらないようにします。
3. ロータリー懸濁液培養におけるオルガノイド (14日間)
- DMEM/F12と培地C(v / v)の1:1混合物、1:200(v / v)サプリメント1、1:100(v / v)サプリメント2 w / o Vitamin A、1:100 L-グルタミン、0.05 mM MEM、100 U / mLペニシリン、100 μg / mLストレプトマイシン、1.6 g / Lインスリン、0.5 μMドルソモルフィン、5 μM SB431542、 および0.05 mM β-メルカプトエタノール。
- 各スピナーフラスコに100 mLの脳オルガノイド培地をサイドアームから加え、インキュベーターに入れて少なくとも20分間温めます。
- メーカーの指示に従って、25rpmで攪拌プログラムを設定します。
手記： EHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアをスピナーフラスコに移す前に、それらがすべて分離されていることを確認してください。EHSマトリックスで2つ以上が接続されている場合は、メスで接続マトリックスを切断して分離します。
- EHSマトリックスに埋め込まれたニューロスフェアを、2 mLの血清ピペットを使用して、100 mLのオルガノイド培地が入ったスピナーフラスコに慎重に移します。スピナーフラスコのサイドアームを使用して、ニューロスフェアをフラスコに移します。
- スピナーフラスコをインキュベーター内の磁気攪拌プラットフォームに37°C、5%CO2で置く;これがオルガノイド培養の0日目である。
- メディウムを週に一度(または色の変更がある場合はより頻繁に)交換するには、メディウムの半分を取り外し、同じ量の新鮮なメディウムを追加します。
手記：スピナーフラスコをインキュベーターから取り出すときは、オルガノイドがフラスコの底に沈むまで3〜5分待ちます。ガラスピペットの先端(ポンプに接続)を液体の表面に置いて、培地を取り除きます。フラスコの片側の開口部/アームを通して培地を慎重に吸引します。これらの操作は、層流フードの下で行う必要があります。