電気刺激による神経幹細胞と前駆細胞の分化

要約

出典:Chang, H. et al., Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices.J. Vis. Exp. (2021年度)

このビデオは、細胞外マトリックスでコーティングされたマイクロ流体チップを使用して、電気刺激を通じて神経幹細胞と前駆細胞またはNPCを区別する方法を示しています。コーティングされた領域に播種して付着した後、NPCは成長し、直流を印加するとニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトへの分化が引き起こされます。

プロトコル

>1. MOE(Multichannel, Optiically Transparent, Electrotactic, MOE)チップの設計と製作

1. 適切なソフトウェアを使用して、個々のポリメチルメタクリレート(PMMA)層と両面テープのパターンを描画します(図1A、材料表)。PMMAシートと両面テープの両方をCO₂レーザーマシンスクライバーでカットします(図1B)。
   1. CO₂レーザースクライバーのスイッチを入れ、パソコンに接続します。ソフトウェアを使用して、デザインしたパターンファイルを開きます。
   2. PMMAシート(275 mm x 400 mm)または両面テープ(210 mm x 297 mm)をレーザースクライバーのプラットフォームに置きます(図2A)。オートフォーカスツールを使用して、PMMAシートまたは両面テープの表面にレーザーを合わせます。
   3. レーザースクライバーをプリンターとして選択し、レーザースクライバーを使用してパターンを「印刷」し、PMMAシートまたは両面テープへの直接アブレーションを開始し、PMMAシートまたはテープに個々のパターンを取得します(図2B)。
2. PMMAシートから保護フィルムをはがし、窒素ガスで表面を清掃します。
   手記：PMMAパターンの描画とPMMAシートの直接加工は、以前のレポートに従って行われました。
3. PMMAシートを複数層接着するには、1 mmのPMMAシートを3枚(1、2、3)積み重ね、5 kg/cm²の圧力でサーマルボンダーで110°Cで30分間接着し、フロー/電気刺激チャネルアセンブリを形成します(図2C)。 < br /> 手記：市販のPMMAシートのバッチが異なれば、ガラス転移温度(Tg)もわずかに異なります。最適なボンディング温度は、Tgの近くで5°C刻みでテストする必要があります。
4. MOEチップアセンブリのレイヤー1の個々の開口部に12個のアダプターを速効性シアノアクリレート接着剤で接着します。
   手記：アダプターは射出成形によりPMMA製です。底面の平らな面はMOEチップに接続するためのものです。1/4W-28雌ネジネジ付きアダプタは、白色のフィンガータイトプラグ、フラットボトムコネクタ、ルアーアダプタの接続用です。速効性シアノアクリレート接着剤を使用する場合は注意してください。目に入るような水しぶきは避けてください。
5. チップを組み立てる前に、1 mm PMMA基板(レイヤー1〜3)、両面テープ(レイヤー4)、および3 mm光学グレードのPMMA(レイヤー5)を紫外線(UV)照射で30分間消毒します(図1A)。
6. 1 mm PMMA基板(レイヤー1〜3)を3 mm光学グレードPMMA(レイヤー5)に両面テープ(レイヤー4)で接着して、PMMAアセンブリ(レイヤー1〜5)を完成させます(図1A)。
7. チップ上のアセンブリ用のきれいなカバーガラスを準備します。
   1. 洗剤を10倍に希釈して染色ジャー(材料の表を参照)に充填し、超音波洗浄機を使用してこの洗剤のカバーガラスを15分間清掃します。
   2. 水道水で汚れたジャーをよくすすぎ、洗剤の痕跡をすべて取り除きます。
   3. 蒸留水で洗い流し続けて、水道水の痕跡をすべて取り除き、手順1.7.2を2回繰り返します。
   4. 清掃したカバーガラスに窒素ガスを吹き付けて乾かします。
8. PMMAアセンブリ(レイヤー1〜5)、両面テープ(レイヤー6)、およびカバーガラス(レイヤー7)をバイオセーフティキャビネット内でUV照射を使用して30分間消毒してから、チップを組み立てます(図1A)。
9. クリーニングしたカバーガラス(レイヤー7)を両面テープ(レイヤー6)でPMMAアセンブリ(レイヤー1〜5)に接着します(図1A)。
10. MOEチップを真空チャンバー内で一晩インキュベートし、その後の手順ではMOEチップアセンブリを使用します(図3)。

2. 細胞培養領域の基材にポリ-L-リジン(PLL)をコーティングする

1. ポリテトラフルオロエチレンチューブ、平底コネクタ、コーンコネクタ、コーンルアーアダプター、白い指締めプラグ(ストッパーとも呼ばれます)、ルアーアダプター、ルアーロックシリンジ、および黒いゴム栓を準備します(図4A、材料表)。上記のすべての成分をオートクレーブ内で121°Cで30分間滅菌します。
2. 寒天ブリッジアダプター(図1A)の開口部を白い指密プラグで密閉します。平底コネクタを中型のインレットアダプターとアウトレットアダプターを介してMOEチップアセンブリに接続します(図4B)。コーンルアーアダプターを3方向ストップコックに接続します。
3. 培地入口の3方向ストップコックに接続する3mLシリンジを使用して、0.01%PLL溶液2mLを加えます(図4B-)。
4. 空の3 mLシリンジを培地出口の3方向ストップコックに接続します(図4B-)。
5. 細胞培養領域をPLL溶液で満たします。コーティング溶液を手動でゆっくりと前後にポンプで送ります。2つの3方向ストップコックを閉じて、培養領域内の溶液を密封します。
6. MOEチップを37°Cで一晩、5%_CO2雰囲気で満たされたインキュベーターでインキュベートします。

3. 塩橋ネットワークの準備

1. 手順2.6に続いて、2つの3方向ストップコックを開き、2つのシリンジを使用してコーティング溶液をチャネル内で手動でポンプで送り返すことにより、チャネル内の気泡を洗い流します。
2. 3 mL の完全培地 (Dulbecco の改変 Eagle 培地と Ham の栄養混合物 F-12 (DMEM/F12)、2% B-27 サプリメント、20 ng/mL EGF、および 20 ng/mL bFGF からなる幹細胞維持培地) を 3 mL シリンジに引き込み、培地入口の 3 方向ストップコックに接続します (図 4B- および 図 4B-).
3. 3 mLの完全培地を添加して、細胞培養領域のコーティング溶液を置き換えます。空の5 mLシリンジを培地コンセントの3方向ストップコックに接続します(図4B-)。
4. ソルトブリッジネットワークを準備します(図5)。
   1. 黒いゴム栓を切って隙間を作り、銀(Ag)/塩化銀(AgCl)電極を黒いゴム栓を通してルアーロックシリンジに挿入します(図4A)。
   2. 白いフィンガータイトプラグをルアーアダプターに交換し、3%のホットアガロースを注入してルアーアダプターを満たします.
      手記：ホットアガロースの調製には、3 gのアガロース粉末を100 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、121°Cのオートクレーブで30分間滅菌します。
   3. ルアーロックシリンジをルアーアダプターに接続します。3%ホットアガロースを黒いゴム栓に注入し、針付きシリンジを使用してルアーロックシリンジを充填します。アガロースが冷えて固まるまで10〜20分待ちます.
      手記：アガロースの容積容量を増やすために、ルアーロックシリンジをルアーアダプターに取り付けます(図4および図5)。次に、大きな電極をルアーロックシリンジに挿入します。電極は、長期間の実験に安定した電気刺激を提供することができます。

>4. mNPCの準備

1. 5% CO₂雰囲気で満たされたインキュベーター内の25T細胞培養フラスコ(37°C)で、完全培地中のmNPCを培養します。細胞を3〜4日ごとに継代し、元のソースから3〜8回の継代を受けた細胞ですべての実験を行います。
2. 細胞懸濁液を15mLの円錐管に移し、ニューロスフェアを100 × gで5分間スピンダウンします。ニューロスフェアを100 × gで5分間スピンダウンします。
3. 1x DPBSを吸引し、ニューロスフェアを完全な培地に再懸濁します。よくやさしく混ぜます。
4. コンセントの3方向ストップコックに接続する1mLの注射器を使用して、1mLのニューロスフェア懸濁液を追加します(図4B-)。

5. DCパルス刺激のためのマイクロ流体システムのセットアップ(図6)

1. セル播種MOEチップを、プログラム可能なX-Y-Z電動ステージに固定された透明なITO(インジウム-スズ-オキシド)ヒーターに取り付けます。
   手記：ITO表面温度は、比例-積分-微分コントローラーによって制御され、37°Cに維持されます。K型熱電対は、チップとITOヒーターの間にクランプされ、チップ内の細胞培養領域の温度を監視します。MOEチップは、プログラム可能なX-Y-Z電動ステージに搭載され、個々のチャンネルセクションでの自動タイムラプス画像取得に適しています。ITOヒーターの作製と細胞培養加熱システムのセットアップについては、前述しました。
2. 媒体の出口を介してMOEチップに手動でポンプで注入することにより、mNPCを注入します。細胞播種MOEチップを37°CのITOヒーターで4時間インキュベー
トします。
3. 4時間後、シリンジポンプを使用して、20 μL/hの流速で、MOEチップを介して全培地を媒体入口にポンプで送ります。
   手記：mNPCは、電界(EF)刺激の前にさらに24時間チップ内で増殖および維持され、細胞の接着および増殖を可能にする。廃液は、図5Aに「廃棄物」として示されている、出口の3方向ストップコックに接続された空の6mLシリンジに収集されます。MOEマイクロ流体システムの構成を図6に示します。このマイクロ流体システムは、細胞に栄養を継続的に供給します。完全な新鮮な培地は、一定のpH値を維持するためにMOEチップに連続的にポンプで送られます。したがって、細胞は_CO2インキュベーターの外で培養できます。
4. 電線を使用して、チップ上のAg/AgCl電極を介してEFマルチプレクサをMOEチップに接続します。EFマルチプレクサとファンクションジェネレータをアンプに接続して、50%のデューティサイクル(50%のタイムオンと50%のタイムオフ)で100Hzの周波数で300mV/mmの大きさの方形波DCパルスを出力します(図6B)。
   1. 電線をEFマルチプレクサに接続します。電線をAg/AgCl電極を介してMOEチップに接続します。
   2. EFマルチプレクサをに接続します amplifier電気線を使用して。ファンクションジェネレータをアンプとデジタルオシロスコープに接続します.
      手記：EFマルチプレクサは、回路内の培養室のインピーダンスを含み、すべての個々のチャンバーを並列電子ネットワークで接続する回路です。3つの培養チャンバーはそれぞれ、マルチプレクサの可変抵抗器(Vr)と電流計(図6AのμA)に直列に電気的に接続されています。各培養室を流れる電流は、Vrを制御することで変化させ、その電流は対応する電流計に表示されます。各細胞培養領域の電界強度は、オームの法則、I=σEA(Iは電流)、σ(DMEM/F12は1.38S・^m-1と設定)は培地の電気伝導率、Eは電界、Aは電界チャンバの断面積によって計算されました。図1に示す細胞培養領域の寸法では、50%のデューティサイクルでのDCパルスとDCパルスの電流はそれぞれ~87mAと~44mAです。
5. mNPCsを100Hzの周波数で300mV/mmの大きさの方形DCパルスに48時間さらします。細胞に十分な栄養を供給し、培地内のpH値を一定に保つために、10μL/hの速度で完全な培地を連続的にポンプで送ります。

結果

図1:マルチチャンネル光学的に透明なエレクトロタクティクスチップの詳細な構成。(A)MOEチップアセンブリの分解図。MOEチップは、PMMAシート(50 mm x 25 mm x 1 mm)、両面テープ(50 mm x 25 mm x 0.07 mm)、アダプター(10 mm x 10 mm x 6 mm)、光学グレードPMMAシート(50 mm x 75 mm x 3 mm)、両面テープ(24 mm x 60 mm x 0.07 mm)で構成されています。 カバーガラス(24mm×60mm)。MOEチップには3つの細胞培養チャンバーがあります。MOEチップには、媒体の入口/出口と寒天塩ブリッジ用の接続穴があります。細胞培養領域(幅3mm×長さ42mm×高さ0.07mm)で細胞を培養した。(B)アダプタ、PMMAシート、両面テー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1 mm PMMA基板(レイヤー1-3)	バーツ	K2R20	ポリメチルメタクリレート(PMMA)、http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mLプラスチックチューブ	プロテックテクノロジーエンタープライズ株式会社	CT-15-PL-TW	キャップ付き円錐形底付きチューブ、組み立て済み、滅菌済み
3 mLシリンジ	テルモ	DVR-3413	3 mL経口注射器、針なし
3 mm光学グレードPMMA(レイヤー5)	CHI MEI株式会社	ACRYPOLY PMMAシート	光学グレードPMMA
3方向ストップコック	ニプロ	NCN-3Lの	滅菌使い捨て3ウェイストップコック
5 mLシリンジ	テルモ	DVR-3410	5 mL経口注射器、針なし
アダプター	Dong Zhong Co., Ltd. (東忠股份有限公司)	カスタマイズ	PMMAアダプター
アガロース	シグマ・アルドリッチ	A9414の	アガロース、低ゲル化温度
増幅器	AAラボシステムズ株式会社	A-304	高電圧アンプ
AutoCAD ソフトウェア	オートデスク	教育版	起案
B-27サプリメント	ギブコ	12587-010	B-27サプリメント(50x)、ビタミンAを除いた
塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)	ペプロテック	AF-100-18B	組換えヒトFGFとも呼ばれる-基本性
ブラックラバーバング	テルモ	DVR-3413	3 mLの経口注射器から、針なし
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	B4287	ブロッキング試薬
遠心機	シャンタイ	CV2060	遠心機
CO2レーザースクライバー	レーザーツールズアンドテクニクス株式会社	ILS-II.(英語)	http://www.lttcorp.com/index.htm から購入
コーンコネクタ	IDEXヘルス&サイエンス	F-120X	ワンピースフィンガータイト10-32コーン、1/16インチODナチュラル用
コーンルアーアダプター	IDEXヘルス&サイエンス	P-659	ルアーアダプター 10-32 メス - メス ルアー、PEEK
共焦点蛍光顕微鏡	ライカマイクロシステムズ	TCS SP5	Leica TCS SP5 ユーザーマニュアル, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
デジカメ	オリンポス	E-330	自動タイムラプス画像取得
デジタルオシロスコープ	テクトロニクス	TDS2024	電子回路またはコンポーネント内の電圧または電流信号を経時的に測定し、振幅と周波数を表示します。
両面テープ	3メートル	ペット8018	http://en.thd.com.tw/ から購入
ダルベッコ改変イーグルスミディアム/ハム栄養混合物F-12(DMEM/F12)	ギブコ	12400024	DMEM/F-12、粉末、HEPES
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	ギブコ	21600010	DPBS、粉末、カルシウム、マグネシウム不使用
EFマルチプレクサ	株式会社アジアティックスカイ	カスタマイズ	個々のチャンネルの電流を監視および制御
上皮成長因子(EGF)	ペプロテック	AF-100-15	組換えヒトEGFとも呼ばれる
速効性シアノアクリレート接着剤	3メートル	7004トン	強度瞬間接着剤(液体)
フラットボトムコネクタ	IDEXヘルス&サイエンス	P-206	フランジレスオスナットデルリン、1/4-28平底、1/16インチ外径ブルー用
関数発生器	アジレント・テクノロジーズ	33120Aの	任意波形機能を内蔵した高性能15MHz合成関数発生器
インジウム-スズ-酸化物(ITO)ガラス	メルク	300739	ITOヒーター用
K型熱電対	テッペル	TPK-02Aの	温度熱電対
ルアーアダプター	IDEXヘルス&サイエンス	P618-01	ルアーアダプターメスルアー-1 / 4-28オスポリプロピレン
ルアーロックシリンジ	テルモ	DVR-3413	寒天塩橋用
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	ベーシックライフ	BL2651	洗浄液
ポリ-L-リジン(PLL)	シグマ	P4707	コーティングソリューション
精密カバーガラス 厚さ1.5H	マリエンフェルト	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
プログラム可能なXYZ電動ステージ	Tanlian Inc (タンリアン	カスタマイズ	http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm から購入
比例-積分-微分(PID)コントローラー	東邦電子	TTM-J4-R-AB	温度コントローラー
PTFEチューブ	Professional Plastics Inc.台湾支店	外径 1/16インチ	白い半透明のPTFEチューブ
シリンジポンプ	ニューエラシステムズ株式会社	NE-1000	NE-1000 プログラマブルシングルシリンジポンプ
TFD4洗剤	フランクラボ	TFD4	カバーガラスクリーナー
サーマルボンダー	クアンミンテック株式会社	カスタマイズ	http://kmtco.com.tw/ から購入
超音波洗浄機	獅子座	レオ-300S	超音波ステリクリーナー
真空チャンバー	DENG YNG INSTRUMENTS CO., LTD. (デン・イン・インスツルメンツ)	ダブ-30	真空乾燥炉
白い指の固定プラグ	IDEXヘルス&サイエンス	P-316	1/4-28 フラットボトム、https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html