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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
>図 1 は、このプロトコルのワークフローの概略を示しています。
1. iPSCの再プログラミングとメンテナンス
- 被験者の血液 (高齢または疾患患者、65 歳以上) の 8 mL をクエン酸ナトリウムを含む細胞調製チューブ (CPT) またはエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) またはヘパリン処理チューブに集めます。
- 1,800 x gで室温(RT)で30分間遠心分離し、末梢血のみを含み血清を含まないペレットを回収します。
- iPSCを得るには、メーカーのプロトコール(材料表を参照)に従って特殊なリプログラミングベクターを使用してください。
- フィーダーフリー、ラクトースデヒドロゲナーゼ浮上ウイルス(LDEV)フリーの還元成長因子基底膜マトリックスコーティングされた6ウェル培養プレート、エッセンシャル8(E8)培地(材料表参照)の6ウェル培養プレートで、5%CO2の加湿雰囲気でiPS細胞を培養します。
- iPS細胞をE8培地に3〜4日間保持し、過密状態や自然分化を避けてください。
- 免疫蛍光マーカーを使用してiPS細胞株の多能性を検証し(ステップ2)、マイコプラズマをテストします(ステップ3)。
2. 多能性染色
- 溶液と抗体を保存するには、分析の3〜4日前に、コーティングされた(ステップ1.4)24ウェル培養プレートに細胞を播種します。ピペットで培地を吸引し、リン酸緩衝生理食塩水(1x PBS)中の4%ホルムアルデヒドで細胞をRTで15〜20分間固定します。
- 細胞を1x PBSで3回洗浄し、0.1% Triton-X 100 in 1% Bochin Serum Armin(BSA)in PBSで少なくとも15分間、RTで1時間以内
透過処理します。
- 1x PBSで3回洗浄し、PBS中の5% BSAでRTで30分間ブロックします。
- 1x PBSで再度3回洗浄し、抗体Sox2およびOct3/4(1:100希釈;材料表を参照)と核染色DAPIを1%BSA(1:4,000希釈)で4°Cで一晩加えます。光から保護するためにアルミホイルで包みます。
- 1x PBSで3回洗浄し、細胞をPBSに残します。蛍光顕微鏡で10〜20倍の倍率で画像化。多能性マーカーである性決定領域Y-box 2(Sox2)および八量体結合転写因子3/4(Oct3/4)が細胞の核に局在していることを確認します。
3. マイコプラズマ検査
>注:詳細なアッセイの実行と分析手順については、検出キットのプロトコル(材料の表を参照)を参照してください。検出キットは、マイコプラズマ検査用の試薬、基質、およびアッセイバッファーを提供します。
- 細胞を継代するか、培地をリフレッシュする前に、2〜3 mLの細胞培養培地を遠心チューブに集め、細胞または破片を200 x gでRTで5分間ペレット化します≤。細胞を培地と少なくとも24時間インキュベートして、検出可能なシグナルを確保します。
- 100 μLの細胞上清を、新しいチューブまたは白壁の96ウェルプレートのウェルに加えます(底部が不透明であることを推奨、材料の表を参照)。試薬と基質をアッセイバッファーに再構成し、室温で15分間平衡化します。
試薬- 100 μLをサンプルに加え、室温で5分間インキュベートします。ルミノメーターで発光を測定します(測定#1)。
- 100 μLの基質をサンプルに加え、室温で10分間インキュベートします。発光を測定します(測定#2)。
- 測定値#2と#1の比率でマイコプラズマ汚染を特定します。結果の解釈については、キットのマニュアルを参照してください。
4. マイクロフィラメントの調製
- ポリ(乳酸-co-グリコール酸)(PLGA、材料表を参照)マイクロフィラメントの調製を開始するには、メスの鈍い端で縫合糸をほつれさせます。擦り切れた繊維を70%エタノールで軽く去勢します。
- 顕微鏡下で定規を使用して、PLGAファイバーを500μmから1mmの長さのストランドに切断し始めます。繊維を合計で約25mmカットします。フィラメントを1mLの抗生物質-抗真菌溶液を入れた15mLのチューブに保管します。
- フード内で、繊維溶液を10 mLのDMEM/F-12で希釈します(表1)。溶液をよく渦巻き
手記： 無菌環境の細胞培養フローフードで作業します。
- 20 μLのファイバー溶液を、96ウェルプレートの3つの胚様体(EB)形成ウェルに加えます。明視野顕微鏡下で、ウェルあたりの繊維をカウントし、平均化します。ウェルあたり平均5〜10個のPLGAマイクロフィラメントに希釈または濃縮します。このように各井戸を準備します。
- これで、ウェルに細胞を播種する準備が整いました。プレートは、必要になるまで室温で、翌日は4°Cで保存してください。
>5. 胚様体(EB)形成
>注:すべてのメディアと溶液はRTに温める必要があります。
- iPSCが70%-80%のコンフルエント度に達すると(図2A)、継代してEB形成に使用する準備が整います。顕微鏡で10倍から20倍の倍率で細胞を確認します。コロニーが自発的な分化の最小限の領域(<10%)を示すことを確認します。
- ピペットで培地を吸引し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を一度洗浄します。500 μLの細胞剥離溶液(材料表を参照)または0.5 mMのEDTAを加えてコロニーを解離し、37°Cで3〜5分間インキュベートします
手記： 無菌環境の細胞培養フローフードで作業します。
- 放出された細胞を1 mLの新鮮なE8培地を各ウェルに加えて収集し、すべての細胞が剥離するまで静かにピペット
で移動します。
- 1.5 mLの細胞懸濁液を15 mLチューブに移し、さらに1 mLの新鮮なE8培地を加えて、総容量2.5 mLにします。
- 290 x gでRTで3分間遠心分離します。
- ピペットで上清を吸引し、50 μM Rho関連プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤を添加したEssential 6(E6、材料表参照)培地1 mLに細胞ペレットを再懸濁し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。
- 50 μMのROCK阻害剤を添加したE6培地で、所望の播種密度に応じて60,000〜90,000細胞/mLの細胞懸濁液を調製します(材料の表を参照)。
- 150 μLの細胞懸濁液を96ウェル超低アタッチメント(ULA)プレート(または調製した凹型プレート)の各ウェルに加えます。ウェルあたり9,000〜11,000個の細胞を播種します。
- プレートを遠心分離機にかけ、室温で1分間、290 x gで細胞を強制的に凝集させ、プレートを37°Cのインキュベーターに5% CO2の加湿雰囲気で置きます。
6. 神経上皮誘導
- 24時間後、ピペットで120μLの培地を慎重に吸引します。ピペットの先端をウェルの奥まで下げてEBを誤嚥しないように注意してください。
- 150 μL の E6 培地 (RT) に 2 μM の XAV939 と Suppressor of Mothers against Decapentaplegic (SMAD) 阻害剤 (ウェルあたり 10 μM の 10 μM の 10 μM SB431542と 500 nM の LDN 193189) を添加します (材料の表を参照)。
- 新たに調製した E6 培地に 2 μM の XAV939、10 μM の SB431542、500 nM の LDN 193189.
を添加して、培地を毎日交換します。
手記：6日目(DIV6)までに、EBの直径は550〜600μmになり、さらなる分化の準備ができているはずです。
>7. オルガノイドの分化と成熟
>注:すべてのメディアはRTにウォームアップする必要があります。
- およそDIV7で、すべてのEBが550-600μmの直径に達し、滑らかで明確なエッジを示しているかどうかを確認し(図2B)、この段階で、それらは細胞外マトリックス(ECM)に埋め込む準備ができている
手記： 無菌環境で作業します。
- 熱可塑性シーリングフィルム(材料の表を参照)から、空のP4ボックス(長さ約200インチ)にフィルムシートを配置して、ディンプル埋め込みシートを準備します(材料の表を参照)。15 mLのコニカルチューブまたは500 μLの微量遠心チューブを使用して、フィルムシートを穴にそっと押し込み、12個のディンプルを作ります。フィルムシートに70%エタノールをスプレーし、UVライトをオンにしてフローフード内で少なくとも30分間乾燥させます。
- 十分な量の基底膜マトリックス(Matrigel、材料の表を参照)を氷上で解凍し、フローフード内に置きます.
手記：EBあたり、約30μLの原液メンブレンマトリックスが必要です。メンブレンマトリックスがゲル化するのを防ぐために、常に4°C未満に保ってください。また、ピペットチップは、ピペッティング中にチップ内での重合からマトリックスを減速させ、材料の損失を減らすため、事前に冷却したピペットチップも推奨されます。
- ワイドボアのP200チップを使用して、各ディンプルに1つのEBを移し、通常のピペットチップでできるだけ多くのメディアを取り除きます。EBを乾かさないように注意してください。通常のP200チップを使用して、各オルガノイドに~30 μLの希釈されていないメンブレンマトリックスを加え、EBが液滴の中心にあることを確認します。
- すべてのEBがマトリックスに埋め込まれたら、EBを含むフィルムシートを滅菌ペトリ皿に置きます.
手記：オプションで、滅菌水で満たされた小さなペトリ皿をフィルムシートの隣の大きなペトリ皿に置いて、蒸発を防ぐことができます。
- ディッシュをインキュベーターに移し、5% CO2を含む加湿雰囲気で37°Cで約10分間インキュベートし、メンブレンマトリックスを固化させます。
- 12個の包埋オルガノイドの各セットについて、ビタミンAを含まないB27を含む5 mLの分化培地(表1)をULA 6ウェルプレートの1ウェルに調製します。プレートをインキュベーターで37°Cに予温します。
- インキュベーション時間が終了したら、フィルムシートを取り出し、シートの裏側からディンプルを押し出して、埋め込まれたEBをULA 6ウェルプレートに移します。必要に応じて、ウェルから1 mLを取り出し、シートにピペットで移して、液滴がフィルムから剥がれるのを助けます><。
手記：重要な形態学的変化は、埋め込みの1日後に見ることができます。EBは、滑らかなエッジから膨らんだ突起に変化し、芽を形成します(図2C)。
- 2 日後 (DIV9) で、ハーフメディア交換を行います。その過程でメンブレンマトリックスの液滴を吸引したり、損傷したりしないように注意してください。
- さらに 2 日後 (DIV11) で、メディアに 3 μM のCHIR99021を補充して、メディア全体の交換を行います (材料の表を参照)。
- DIV14では、培地をビタミンAを含むB27を含む分化培地に変更し(表1)、オルガノイドサイズを徐々に増やします。
- DIV16で、ウェルプレートをインキュベーター内の90rpmのオービタルシェーカーに置きます。メディアは2日ごとに交換してください。
- 40 DIV ごとに、培地 50 mL ごとに 500 μL のメンブレンマトリックスを希釈して、培地中の追加の栄養素を確保します。
>表1:本研究で用いた分化媒体の構成。
| 試薬 | 最終濃度 | 容量(合計50mL) |
| DMEM-F12 | 50% | 25ミリリットル |
| ニューロベースルミディアム | 50% | 25ミリリットル |
| N2サプリメント(100x) | 1倍 | 0.25ミリリットル |
| B27サプリメント-/+ビタミンA(50x) | 0.5倍 | 0.5ミリリットル |
| インスリン | 0.25パーセント | 12.5 μL |
| GlutaMAX (100倍) | 1倍 | 0.5ミリリットル |
| MEM-NEAA (100x) | 0.5倍 | 0.25ミリリットル |
| HEPESの(1メートル) | 10 mM | 0.5ミリリットル |
| 抗生物質/抗真菌薬 (100x) | 1倍 | 0.5ミリリットル |
| 2-β-メルカプトエタノール | 50 μM | 17.5μL |
| >注:一部のDMEM-F12にはすでにGlutaMAXが含まれているため、追加する必要はありません。 |
