マイクロ流体デバイスを用いた神経筋接合部の生成

Abstract

出典:Stoklund Dittlau, K. et al., Generation of Human Motor units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices.J. Vis. Exp. (2021年度)

マイクロ流体デバイスを使用して神経筋接合部の形成を実演しています。神経前駆細胞と筋前駆細胞は、デバイス内の異なるウェルに播種され、それぞれ運動ニューロンと筋管に成熟するまで放置されます。体積と化学的勾配の生成は、活動的な神経筋接合部の発達につながります。

Protocol

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

このプロトコールで使用されるすべての試薬と機器は、材料の表に記載されており、滅菌して使用する必要があります。メディアは、特に指定がない限り、使用前に室温(RT)に加熱する必要があります。共培養プロトコルの概要については、図1を参照してください。

1. 人工多能性幹細胞(iPSC)からの運動ニューロン前駆細胞の分化

1. 以前の研究から適応された運動ニューロン分化プロトコルに従って、10日目の神経前駆細胞(NPC)状態に到達します。プロトコルの時間枠によると、分化は月曜日(0日目)に開始され、その結果、木曜日に10日目のNPCが
誕生します。
2. 10%ジメチルスルホキシド(DMSO)によるノックアウト血清置換における10日目のNPCを、バイアルあたり2 x 10⁶- 4 x^{10 6}細胞の密度で凍結保存します。
   注意：DMSOは有毒です:個人用保護具と一緒にドラフトで取り扱ってください.
   注:1日の約50%の10人のNPCが解凍時に活力を発揮すると予想されています。....

Results

図1:マイクロ流体デバイスにおけるモーターユニットプロトコルの概略図。運動ニューロン分化プロトコルのタイムラインに従った 0 日目から 28 日目までの分化タイムラインと共培養の概要。運動ニューロンとiPS細胞の分化は0日目に開始され、その後10日間、前述のように行われます。9日目に、デバイスを滅菌し、PLOラミニンでコーティングします。MABは、T75フラスコで膨張するために解凍されます。10日目に、運動ニューロン-NPCは、両方のウェルとデバイスの1つのコンパートメント(薄い灰色)のチャネルにプレーティングされ、そこで運動ニューロンへの分化が1週間継続されます。MABは、17日目に両方のウェルと反対側のコンパートメントのチャネル(濃い灰色)にメッキされます。18日目に、MABの筋管への分化が始まります。21日目に、デバイスのマイクログルーブを介して運動ニューロン-神経突起分極を促進するために.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酢酸	CHEM-Labネバダ州	CL00.0116.1000	コーティング部品。H226、H314。P280
Agrin(組換えヒトタンパク質)	研究開発体制	6624-AG-050	メディアサプリメント
アスコルビン酸	シグマ	A4403の	メディアコンポーネント
βIII-チューブリン(チューブリン)	アブカム	AB7751	抗体 (1:500)
β-メルカプトエタノール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31350010	メディアコンポーネント。H317.P280です。
ビタミンAを含まないB-27	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12587-010	メディアコンポーネント
BDNF(脳由来神経栄養因子)	ペプロテック	450-02B	成長要因
bFGF(組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子)	ペプロテック	100-18B	成長要因
カーフスキン由来のコラーゲン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17104019	コーティング部品
CNTF(毛様体神経栄養因子)	ペプロテック	450-13B	成長要因
DAPT	トクリス・バイオサイエンス	2634	メディアサプリメント
DMEM/F12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11330032	メディアコンポーネント
DMSOの	シグマ	D2650-100ミリリットル	凍結保存コンポーネント。H315、H319、H335。P280です。
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190250	カルシウム、マグネシウムなし
エタノール	VWRの	20.821.296	殺菌。H225.P280
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10270106	メディアコンポーネント
蛍光封入剤	ダコ	S3023	免疫細胞化学コンポーネント
GDNF(グリア細胞株由来神経栄養因子)	ペプロテック	450-10B	成長要因
馬の美容液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16050122	メディアコンポーネント
IMDM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12440053	メディアコンポーネント
インスリントランスフェリンセレン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	41400045	メディアコンポーネント
ノックアウト血清の補充	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10828-028	凍結保存成分
Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫基底膜由来のラミニン	シグマ	L2020-1MG	コーティング成分および培地サプリメント
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25030-024	メディアコンポーネント
N-2サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17502-048	メディアコンポーネント
神経基礎媒体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049	コーティングおよびメディアコンポーネント
非必須アミノ酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140050	メディアコンポーネント
パラフィルムM	シグマ	P7793-1EA	機器の保管
ペニシリン/ストレプトマイシン(5000 U / mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15070063	メディアコンポーネント
シャーレ(3cm)	ヌンク	153066	直径: 3 cm
ペトリ皿(10cm)	ザルシュテット	833.902	直径: 10 cm
プレート(6ウェル)	セルスター・グライナー バイオワン	657160	培養プレート
ポリ-L-オルニチン(PLO)	シグマ	P3655-100MG	コーティング部品
レチノイン酸	シグマ	R2625	メディアサプリメント。H302、H315、H360FD、H410。P280です。
Revita細胞サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A2644501	ROCK阻害剤溶液
スムージングされたアゴニスト	マーチミリポア	566660	メディアサプリメント
ピルビン酸ナトリウム	ライフテクノロジー	11360-070	メディアコンポーネント
T75フラスコ	シグマ	CLS3276	培養プレート
TrypLEエクスプレス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12605010	MAB解離ソリューション
塩酸ツボシラリン五水和物	シグマ	T2379-100Gの	アセチルコリン受容体遮断薬。H301です。P280です。
XonaChips組み立て済みマイクロ流体デバイス	Xonaマイクロフルイディクス	XC150	マイクログルーブ長さ:150μm