マイクロ流体デバイスを用いた神経筋接合部の生成

要約

出典:Stoklund Dittlau, K. et al., Generation of Human Motor units with Functional Neuromuscular Junctions in Microfluidic Devices.J. Vis. Exp. (2021年度)

マイクロ流体デバイスを使用して神経筋接合部の形成を実演しています。神経前駆細胞と筋前駆細胞は、デバイス内の異なるウェルに播種され、それぞれ運動ニューロンと筋管に成熟するまで放置されます。体積と化学的勾配の生成は、活動的な神経筋接合部の発達につながります。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

このプロトコールで使用されるすべての試薬と機器は、材料の表に記載されており、滅菌して使用する必要があります。メディアは、特に指定がない限り、使用前に室温(RT)に加熱する必要があります。共培養プロトコルの概要については、図1を参照してください。

1. 人工多能性幹細胞(iPSC)からの運動ニューロン前駆細胞の分化

1. 以前の研究から適応された運動ニューロン分化プロトコルに従って、10日目の神経前駆細胞(NPC)状態に到達します。プロトコルの時間枠によると、分化は月曜日(0日目)に開始され、その結果、木曜日に10日目のNPCが
誕生します。
2. 10%ジメチルスルホキシド(DMSO)によるノックアウト血清置換における10日目のNPCを、バイアルあたり2 x 10⁶- 4 x^{10 6}細胞の密度で凍結保存します。
   注意：DMSOは有毒です:個人用保護具と一緒にドラフトで取り扱ってください.
   注:1日の約50%の10人のNPCが解凍時に活力を発揮すると予想されています。この「10日目のNPC」状態で運動ニューロン分化プロトコルを停止し、NPCを凍結保存して多数のNPCを生成し、後でバンクして使用できるようにすることで、共培養プロトコルの全体的なタイムラインの長さを合計28日から19日に短縮します。

2. ヒト中血管芽細胞(MABs)の導出と維持

>注:MABは血管関連間葉系幹細胞であり、この場合、58歳の健康なドナーから採取した生検から採取されています。代替の商用ソースが利用可能です。MABを取得するためのプロトコルについて簡単に説明します。詳細については、詳細なプロトコルを参照してください。すべてのMAB培地は、使用前に37°Cに加熱する必要があります。

1. 生検組織をみじん切りにし、コラーゲン(カーフスキン由来)でコーティングした6cmの皿(表1)で2週間インキュベートします。媒体は4日ごとに交換してください。
   1. コラーゲンコーティングを調製するには、100 mgのコラーゲンを20 mLの0.1 M酢酸に溶解します。コラーゲンは溶けるのに時間がかかるので、混合物をRTでロッキングプラットフォームに一晩置きます。翌日、80 mL の ddH₂O を最終容量 100 mL まで補充します。
      注意：酢酸は有毒です。個人用保護具付きのドラフトで取り扱ってください。
      手記：カーフスキンコーティングのコラーゲンは、最大5倍まで再利用できます。4°Cで保存してください。
   2. 皿またはフラスコの表面全体にコラーゲンをコーティングし、閉じて、層流内のRTで20分間インキュベートします。20分後、コラーゲンを新しい容器に戻し、空の皿/フラスコを閉じ、層流のRTで10分間放置します。
   3. ディッシュ/フラスコをインキュベーターに移し、一晩(または少なくとも6時間)インキュベーションします(37°C、5%CO₂)。細胞をプレーティングする前に、カルシウムまたはマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で5回洗浄します。
2. 14日後、FACS(蛍光活性化細胞ソーティング)により、MABのヒトアルカリホスファターゼが選別され、続いてさらに増殖します。コラーゲンコーティングされたT75フラスコのMABを増殖培地に保持し、増殖培地を2日ごとに交換します(フラスコあたり10mL)。
3. 70%の合流点に達したときに、デバイスでMABを凍結保存、継代、または播種します.
   手記：MABは、細胞間接触による自然融合により、筋原性の可能性を失います。MAB を拡張するときは、70% の合流点を超えないようにしてください。1つの70%コンフルエントT75フラスコには約600,000〜800,000個の細胞が含まれており、バイアルあたり100,000個の細胞で凍結保存できます。各バイアルは、後で解凍し、T75フラスコに播種して膨張させることができます。
4. MABを継代するには、7 mLのDPBSで1回穏やかに洗浄した後、7 mLのMAB解離溶液で5%_CO2の37°Cで3分間インキュベートし、細胞を解離します。
   1. MAB解離溶液を7 mLの増殖培地で中和し、細胞を穏やかに掻き取り、細胞懸濁液を50 mLの遠心チューブに移します。フラスコを予備の5 mLの増殖培地で優しく洗浄し、残っている可能性のあるMABを回収します。
   2. 細胞懸濁液を300 x gで3分間遠心分離し、その後、新しいコラーゲン被覆T75フラスコに直接通路して増殖させ、10% DMSOによるノックアウト血清置換で凍結保存するか、マイクロ流体デバイスで播種するためにカウントします
      注:継代は、細胞増殖のために週に1回〜2回行われ、最大継代回数は13回になります。解離すると、MABは顕微鏡で調べると球形で大きく見えます。

3. 組み立て済みのマイクロ流体デバイスの準備 - 9日目

>注:このプロトコルは、マイクロ流体デバイスメーカーのニューロンデバイスプロトコルから適応されており、組み立て済みのデバイスとシリコンデバイスの両方を使用するように調整されています。ここでは、免疫細胞化学(ICC)および生細胞カルシウム一過性記録には組み立て済みのデバイスが使用され、走査型電子顕微鏡(SEM)にはシリコンデバイスが使用されます。プロトコルのタイムラインは、運動ニューロン分化プロトコルのタイムラインに従います。

1. コーティングは一晩でインキュベートする必要があるため、細胞を播種する前日にマイクロ流体デバイスを準備します。運動ニューロンのプロトコルによると、これは水曜日になります。10cmのシャーレに~10mLの70-100%エタノールを加えます。鉗子を使用して、デバイスを輸送用コンテナからペトリ皿に移し、滅菌します。
2. 装置をエタノールに10秒間浸し、鉗子で装置を紙に移し、層流で~30分間空気乾燥させます。デバイスが乾いたら、鉗子を使用して各デバイスを個別の10cmシャーレに移動し、取り扱いを容易にします。
   注意：エタノールは有毒です。個人用保護具付きのドラフト内のハンドル
3. DPBSでポリ-L-オルニチン(PLO)(100 μg/mL)をデバイスにコーティングし、37°C、5%CO₂で3時間インキュベートします。
   1. P200ピペットを使用して、DPBS中の100 μLのPLOをチャネル開口部のできるだけ近くでトップウェルに添加し、トップウェルからチャネルを通ってボトムウェルに流れる流体を観察します。続いて、DPBS中のPLO100 μLをボトムウェルに加えます。
   2. マイクログルーブの反対側で繰り返し、デバイスの片側に100μLを追加して終了し、デバイスの2つのミラーリングされた側面の間にボリュームグラデーションを作成し、マイクログルーブをコーティングします(たとえば、右側200μL、左側300μL)。3時間後、デバイスをDPBSで5分間3回洗浄します。必要に応じて吸引システムを使用してください.
      手記：細胞のコーティングまたは培養中の任意の時点で、チャネルに気泡が形成されないように注意してください。小さな気泡でも短時間で膨張するため、コーティング、細胞播種、またはチャネルを横切る培地の流れが阻害されます。コーティング中に流体がチャネル内で停止した場合は、PLO溶液を両側から直接チャネルに再懸濁します。気泡がまだ存在する場合は、200 μLのDPBSを使用してチャネルをフラッシュし、上記の手順3.3.1-3.3.2で説明したコーティングプロセスを繰り返します。細胞播種後に気泡が発生した場合、チャネルをフラッシュすると細胞が損傷するため、デバイスを回復することはできません。
4. デバイスを神経基礎培地にラミニン(20 μg/mL)でコーティングし、37 °C、5% CO₂で一晩インキュベートします。手順3.3.1〜3.3.2のPLOコーティングについても同じ手順に従います。
5. 翌日、P200ピペットを使用し、チップをチャネル開口部の反対側のウェルに配置して、ウェルからラミニンコーティングを取り除きます。すべてのウェルにDPBSを添加し、細胞播種のためにRTの層流にDPBSを搭載したデバイスを残します.
   注:この時点から、気泡の形成を引き起こす可能性があるため、液体(ラミニンコーティング、DPBS、メディア、固定液など)をチャネルから直接取り除かないことが重要です。細胞を播種する前に、必ず顕微鏡でデバイスを検査してください。

4. マイクロ流体デバイスへのNPCのめっき - 10日目

>注:運動ニューロン分化プロトコルによると、10日目のNPCのプレーティングは木曜日に行われます。

1. 解離したばかりの10日目のNPCを使用するか、10日目の運動ニューロン培地(表2および表3)の10mLあたり1〜2バイアルのバンクNPCをROCK阻害剤(10μL / mL)溶液で解凍し、細胞懸濁液を100 x gで4分間遠心分離します。
2. 細胞ペレットを500-1000 μLの10日目運動ニューロン培地に再懸濁し、ROCK阻害剤(10 μL/mL)溶液と共に溶解し、任意の計数方法を用いて生細胞をカウントします。
   手記：以下で述べるように、最適な播種量に対応するために、NPCを正しい量の培地に再懸濁してください。
3. P200ピペットを使用して、デバイスのマイクログルーブの片側にある2つのウェルからDPBSを取り出し、10日目の運動ニューロン培地の60〜100μLにデバイスあたり250,000個のNPCを播種します。
   1. 右上のウェルで、細胞懸濁液(125,000細胞)の30〜50μLをチャネル開口部の近くに45°の角度で播種し、残りの液体をピペットチップでウェルの床に沿ってウェルの中心に向かって穏やかに引きずります。
   2. 数秒間一時停止して細胞懸濁液がチャネルを流れるのを待ってから、下部のウェル(30〜50μL中の125,000細胞)でこれを繰り返します。ペンを使用して、シードされた面を「NPC」または同等のものにマークし、顕微鏡なしでデバイスの向きを簡単に合わせることができます。
   3. デバイスを 37 °C、5% CO₂ で 5 分間インキュベートして細胞接着を可能とした後、2 シードウェルに追加の Day 10 運動ニューロン培地 (合計 200 μL/ウェル) を補充し、37 °C、5% CO₂.
      で再度インキュベートします 手記：各ウェルには200 μLを充填でき、ウェルとチャネルの両方に細胞を播種することで、培養物の強固な構造を確保し、培地交換時の細胞剥離のリスクを低減します。チャネルだけでシードする細胞の数を減らすことができます。ただし、これにより、培地が各媒体交換中にチャネルを流れる体積電流の影響を受けやすくなります。
4. P200ピペットを使用して、播種したばかりのNPCの反対側にあるマイクログルーブの反対側にある2つのウェルからDPBSを取り出します。10日目の運動ニューロン培地を200μL/ウェル追加し、上部と下部のウェルの間で数秒待って、培地がチャネルを流れるようにします。次に、インキュベーション中の培地の蒸発を防ぐために、デバイスの周囲に10cmディッシュあたり6mLのDPBSを追加します
   手記：必要に応じて、培養期間中にデバイスの周囲にDPBSを追加します。
5. 11日目(金曜日)、14日目(月曜日)、および16日目(水曜日)に、デバイスの両方のコンパートメントで完全な運動ニューロン媒体の変更を実行します(表2および表3)。培地交換の日に新しい培地サプリメントを追加してください。
   手記：これ以降、P200ピペットですべての培地交換を行います。ピペットチップは常にウェルの端のチャネルから離して配置し、チャネルから直接液体を取り除かないでください。シリコンデバイスを取り外しないように注意してください。培地の取り出しと追加は、細胞の剥離を防ぐためにゆっくりと行う必要があります。
   1. NPCを含む両方のウェル内のすべての培地を慎重に取り除きます。これには、P200ピペットチップをウェル壁の下端、チャンネル開口部の反対側に配置します。P200ピペットチップをチャネル開口部の反対側のウェル壁の上端に配置して、50〜100μLの新鮮な運動ニューロン培地をトップウェルにゆっくりと加えます。
   2. 数秒間一時停止して、培地がチャネルを流れるのを待ってから、50〜100μLの運動ニューロン培地をボトムウェルに加えます。このプロセスを慎重に繰り返して、両方のウェルに200 μL/ウェルが含まれるようにします。セルのない側で繰り返します。

5. マイクロ流体デバイスにおけるMABのめっき - 17日目

1. マイクロ流体デバイスにMABを播種する約7日前(運動ニューロン分化の10日目)に、MABを解凍し、コラーゲンでコーティングしたT75フラスコの増殖培地(表1)に播種して、十分な細胞増殖を可能にします。セクション2を参照してください。
2. 運動ニューロン分化の17日目(木曜日)に、ステップ2.4で説明したようにMABを解離し、細胞ペレットを~500μLの成長培地に再懸濁し、任意の好ましい計数方法を使用して生細胞をカウントします。
   手記：以下で述べるように、最適な播種量に対応するために、MABを正しい量の培地に再懸濁してください。
3. P200ピペットでデバイスのマイクログルーブのシードされていない側の運動ニューロン培地を取り出し、DPBSで優しく洗浄し、デバイスあたり200,000 MABsを60〜100 μLの成長培地に播種します。
   1. 右上のウェルで、30〜50μLの細胞懸濁液(100,000細胞)をチャネル開口部の近くに45°の角度で播種し、残りの液体をピペットチップでウェルの床に沿ってウェルの中心に向かって穏やかに引きずります。数秒間一時停止して、チャネルを通る細胞の流れを待ってから、下部のウェル(30〜50μL中の100,000細胞)で繰り返します。
   2. デバイスを37°C、5%CO₂で5分間インキュベートして細胞接着させてから、新たにMAB播種した2つのウェルに追加の増殖培地(合計200 μL/ウェル)を補充します。37 °C、5% CO₂.
      で再度インキュベートします。 注: デバイスの運動ニューロン側の 17 日目に中程度の変更は必要ありません。17日目の媒体変更は、以前に発表された運動ニューロン分化法に従って、代わりに18日目(金曜日)に実行されます。

6. MABコンパートメントへの運動ニューロン神経突起の成長を促進するための体積および走化性勾配の実施

1. 18日目に、18日目の運動ニューロン培地(200μL /ウェル)を使用して、運動ニューロン側で完全な培地交換を行います。手順 4.5.1 から 4.5.2 で説明した中程度の変更の手順に従います。デバイスのMABコンパートメントでMABの分化を開始します(表2および表4)。
   1. 0.01 μg/mLのヒトアグリン(200 μL/well)を添加した予熱MAB分化培地(表4)を添加する前に、MABコンパートメントをDPBSで一度慎重に洗浄します。
      手記：MABは、1週間の時間経過で融合して多核筋管を形成します。
2. 21 日目に、運動ニューロン分化プロトコル (月曜日) に従って、走化性および体積勾配 (表 2 および表 3) を開始します。
   1. 200 μL/ウェルの運動ニューロン基礎培地に、30 ng/mLの脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、ヒトアグリン(0.01 μg/mL)、およびラミニン(20 μg/mL)を筋管コンパートメント(以前はMABコンパートメントとして定義)に加えます。成長因子を含まない運動ニューロン基礎培地(100μL /ウェル)を運動ニューロンコンパートメントに加えます。

>表1:MAB増殖培地。培地は4°Cで2週間持続します。bFGFは使用日に新鮮に添加されます。

の

試薬	ストック濃度	最終濃度
IMDM	1倍	80パーセント
ウシ胎児血清		15%
ペニシリン/ストレプトマイシン	5000 U/mL	0.5パーセント
L-グルタミン	50倍	1%
ピルビン酸ナトリウム	100 mM	1%
非必須アミノ酸	100倍	1%
インスリントランスフェリンセレン	100倍	1%
bFGF(新鮮に添加)	50 μg/mL	5 ng/mL

>表2:運動ニューロン基底媒体。ミディアムは4°Cで4週間持続します。

試薬	ストック濃度	最終濃度
DMEM/F12		50%
神経基礎媒体		50%
ペニシリン/ストレプトマイシン	5000 U/mL	1%
L-グルタミン	50倍	0.5 %
N-2サプリメント	100倍	1%
ビタミンAを含まないB-27	50倍	2%
β-メルカプトエタノール	50 mM	0.1パーセント
アスコルビン酸	200 μM	0.5 μM

>表3:運動ニューロン媒体のサプリメント。サプリメントは、使用日に運動ニューロン基礎培地に新鮮に加えられます。

の の の の の の

日	試薬	ストック濃度	最終濃度	コンパートメント
10/11 日目	スムージングされたアゴニスト	10 mM	500 nM	両方とも
	レチノイン酸	1 mM	0.1 μM
	DAPT	100 mM	10 μM
	BDNFの	0.1 mg/mL	10 ng/mL
	GDNFの	0.1 mg/mL	10 ng/mL
14日目	DAPT	100 mM	20 μM	両方とも
	BDNFの	0.1 mg/mL	10 ng/mL
	GDNFの	0.1 mg/mL	10 ng/mL
16日目	DAPT	100 mM	20 μM	両方とも
	BDNFの	0.1 mg/mL	10 ng/mL
	GDNFの	0.1 mg/mL	10 ng/mL
	CNTF	0.1 mg/mL	10 ng/mL
18日目	BDNFの	0.1 mg/mL	10 ng/mL	運動ニューロン
	GDNFの	0.1 mg/mL	10 ng/mL
	CNTF	0.1 mg/mL	10 ng/mL
21日目+	BDNFの	0.1 mg/mL	30 ng/mL	マイオチューブ
	GDNFの	0.1 mg/mL	30 ng/mL
	CNTF	0.1 mg/mL	30 ng/mL
	アグリン	50 μg/mL	0.01 μg/mL
	ラミニン	1 mg/mL	20 μg/mL
21日目+	サプリメントはありません			運動ニューロン

>表4:MAB分化媒体。ミディアムは4°Cで2週間持続します.アグリンは使用日に新鮮に追加されます。

日	試薬	ストック濃度	最終濃度	コンパートメント
18日目	DMEM/F12		97パーセント	MAB
	ピルビン酸ナトリウム	100 mM	1%
	馬の美容液		2%
	アグリン	50 μg/mL	0.01 μg/mL

結果

図1:マイクロ流体デバイスにおけるモーターユニットプロトコルの概略図。運動ニューロン分化プロトコルのタイムラインに従った 0 日目から 28 日目までの分化タイムラインと共培養の概要。運動ニューロンとiPS細胞の分化は0日目に開始され、その後10日間、前述のように行われます。9日目に、デバイスを滅菌し、PLOラミニンでコーティングします。MABは、T75フラスコで膨張するために解凍されます。10日目に、運動ニューロン-NPCは、両方のウェルとデバイスの1つのコンパートメント(薄い灰色)のチャネルにプレーティングされ、そこで運動ニューロンへの分化が1週間継続されます。MABは、17日目に両方のウェルと反対側のコンパートメントのチャネル(濃い灰色)にメッキされます。18日目に、MABの筋管への分化が始まります。21日目に、デバイスのマイクログルーブを介して運動ニューロン-神経突起分極を促進するために...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
酢酸	CHEM-Labネバダ州	CL00.0116.1000	コーティング部品。H226、H314。P280
Agrin(組換えヒトタンパク質)	研究開発体制	6624-AG-050	メディアサプリメント
アスコルビン酸	シグマ	A4403の	メディアコンポーネント
βIII-チューブリン(チューブリン)	アブカム	AB7751	抗体 (1:500)
β-メルカプトエタノール	サーモフィッシャーサイエンティフィック	31350010	メディアコンポーネント。H317.P280です。
ビタミンAを含まないB-27	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12587-010	メディアコンポーネント
BDNF(脳由来神経栄養因子)	ペプロテック	450-02B	成長要因
bFGF(組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子)	ペプロテック	100-18B	成長要因
カーフスキン由来のコラーゲン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17104019	コーティング部品
CNTF(毛様体神経栄養因子)	ペプロテック	450-13B	成長要因
DAPT	トクリス・バイオサイエンス	2634	メディアサプリメント
DMEM/F12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11330032	メディアコンポーネント
DMSOの	シグマ	D2650-100ミリリットル	凍結保存コンポーネント。H315、H319、H335。P280です。
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190250	カルシウム、マグネシウムなし
エタノール	VWRの	20.821.296	殺菌。H225.P280
ウシ胎児血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10270106	メディアコンポーネント
蛍光封入剤	ダコ	S3023	免疫細胞化学コンポーネント
GDNF(グリア細胞株由来神経栄養因子)	ペプロテック	450-10B	成長要因
馬の美容液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16050122	メディアコンポーネント
IMDM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12440053	メディアコンポーネント
インスリントランスフェリンセレン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	41400045	メディアコンポーネント
ノックアウト血清の補充	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10828-028	凍結保存成分
Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫基底膜由来のラミニン	シグマ	L2020-1MG	コーティング成分および培地サプリメント
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25030-024	メディアコンポーネント
N-2サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17502-048	メディアコンポーネント
神経基礎媒体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049	コーティングおよびメディアコンポーネント
非必須アミノ酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11140050	メディアコンポーネント
パラフィルムM	シグマ	P7793-1EA	機器の保管
ペニシリン/ストレプトマイシン(5000 U / mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15070063	メディアコンポーネント
シャーレ(3cm)	ヌンク	153066	直径: 3 cm
ペトリ皿(10cm)	ザルシュテット	833.902	直径: 10 cm
プレート(6ウェル)	セルスター・グライナー バイオワン	657160	培養プレート
ポリ-L-オルニチン(PLO)	シグマ	P3655-100MG	コーティング部品
レチノイン酸	シグマ	R2625	メディアサプリメント。H302、H315、H360FD、H410。P280です。
Revita細胞サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A2644501	ROCK阻害剤溶液
スムージングされたアゴニスト	マーチミリポア	566660	メディアサプリメント
ピルビン酸ナトリウム	ライフテクノロジー	11360-070	メディアコンポーネント
T75フラスコ	シグマ	CLS3276	培養プレート
TrypLEエクスプレス	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12605010	MAB解離ソリューション
塩酸ツボシラリン五水和物	シグマ	T2379-100Gの	アセチルコリン受容体遮断薬。H301です。P280です。
XonaChips組み立て済みマイクロ流体デバイス	Xonaマイクロフルイディクス	XC150	マイクログルーブ長さ:150μm

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