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サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. 胚の解剖と組織の解離
- 動物施設内の定期的な明暗スケジュール(午前7時から午後7時)の下で、一定の温度(22±1°C)および相対湿度(50%)で成体の雌ラット(200〜250 g)を飼育します。食料と水が自由に入手できることを確認してください。
- 3%イソフルランを使用して、発生の18日後(E18)に妊娠中の雌ラットに麻酔をかけます。.次に、頸椎脱臼によって動物を犠牲にします。
- 各ラットの胚から海馬を取り出し、Ca2+およびMg2+を含まない氷冷ハンクのバランスの取れた塩溶液に入れます。発生の18日目では、海馬と皮質の組織は非常に柔らかく、細かく切る必要はありません。詳細については、こちらをご覧ください。
- 0.05%のDNAseを含む0.125%のTrypsin/Hank's溶液で組織を37°Cで18〜20分間解離します。
- パスツールピペットで上清溶液を取り除き、10%ウシ胎児血清(FBS)を含む培地を5分間加えて酵素消化を停止します。
- FBSで培地を取り出し、サプリメントの入った培地、1% L-グルタミン、ゲンタマイシン10 μg/mlで一度洗浄し、パスツールピペットで培地を再度取り出し、少量(500 μl)の増殖培地とそのサプリメント、1% L-グルタミン、ゲンタマイシン10 μg/mlを再び補充します。
- 細胞の乳白色の懸濁液が明らかになるまで、細いパスツールピペットで組織ペレットを機械的に解離します。細胞懸濁液を遠心分離する必要はありません。
- 少量の細胞懸濁液を増殖培地で希釈して、最終容量2.0 mLを得ます。得られた細胞濃度を血球計算盤チャンバーでカウントします。この濃度を1:5に希釈して、600〜700細胞/μlの所望の細胞濃度を得ます。
2. セルめっき
- 約2,000細胞/ mm2の密度でMEAの活性領域に細胞をプレート化し、PDMS制約によって定義され、2Dニューロンネットワークを作成します。
手記：各海馬には、約5 x 105個の細胞が含まれています(単一胚の場合は1 x 106)。6つの胚を解剖して、2 mL中に6 x 106細胞の合計量が得られ、推定濃度は3,000細胞/μlです。この濃度を1:5で希釈して目的の細胞濃度を取得し、約600〜700細胞/μlをプレート化します。PDMS制約によって区切られるMEA面積が約7.065 mm2であり、プレーティングされたセルの総数が600セル/μl x 24μl=14,400セルであるとすると、最終密度は2,038セル/mm2となる。
- MEAデバイスを加湿CO2雰囲気(5%)で37°Cのインキュベーターに入れます。
- 細胞濃度600-700細胞/μl(約100,000細胞)の懸濁液160μlをマルチウェルプレート内部に配置したマイクロビーズ単分子膜の表面に分配し、三次元培養を構築するための準備ステップを完了します。マルチウェルプレートを加湿したCO2雰囲気(5%)を37°Cのインキュベーターに入れます。
3. 3D 神経回路網の構築
- めっき後6〜8時間後、約30〜40μlの容量のピペットセットを使用して、PDMS制約で区切られた領域内にマルチウェルプレートからの懸濁液(ニューロンを含むマイクロビーズ)を非常に慎重に移します。各移送後、マイクロビーズが六角形のコンパクトな構造で自己組織化できるように、約30分待ちます。
- すべての層が堆積し、自発的に組み立てられたら、PDMS制約で区切られた領域の上部に約300μlの培地を大粒で補充します。
- MEAに結合した3D構造をインキュベーター(T = 37.0°C、CO2 = 5%)に48時間置いてから、最終容量(約1 mL)の増殖培地培養物とそのサプリメントを加えます
手記：メンブレンインサート付きマルチウェルプレート上のビーズの総数(30,000)と、MEAデバイス上の単層上のビーズの数(6,000)を考えてみましょう。結果として得られる3D構造は、マイクロビーズと細胞の5つの層で構成されています。3Dニューロンネットワークが幾何学的に完全ではないことを考えると、結果として得られる3D構造は5〜8層で構成される可能性があります。
- めっきの翌日、MEAリング内に培地の最終容量(約900μl)を慎重に加えます。3D培養物を加湿したCO2雰囲気(5%)で37°Cに4〜5週間維持します。週に一度、培地の半分を交換してください。