動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 皮質アストロサイトの調製と培養
>注:次のステップに進む前に、プロトコルのこれらのステップを少なくとも7 d完了してください。なぜなら、アストロサイト培養物はニューロンが準備される前にコンフルエントな単層に発達するはずです。初代アストロサイトは、出生後(P)0-3頃にマウスの仔から得られた混合グリア培養物に由来します。T75フラスコごとに3つの脳(6つの皮質)が使用されます。
- 無菌条件下で、ダルベッコのモディファイドイーグル培地(DMEM)に10% v / vウマ血清と0.1%v / vゲンタマイシンを添加して、アストロサイト培地を調製します。培地は4°Cで最大2週間保存してください。
- 3x T75フラスコに10 μg/mLのポリ-D-リジン(PDL;細胞培養グレードの水)を6% v/v CO2の存在下で37°Cで少なくとも1時間塗布します。コーティング後、フラスコをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄して結合していない陽イオンを除去し、9 mLのアストロサイト培地を加えます。
- 脳の準備には、10 mLのハンクス平衡塩溶液(HBSS)を1x 10 cmシャーレに追加し、1 mLのHBSSを1x 15 mLチューブに追加します(使用する脳の数に関係なく)。手術用ハサミ、細い鉗子2本、双眼鏡を手の届くところに置いてください。
- 手術用ハサミで3匹の子犬をすばやく斬首し、空の10cm皿に頭を集めます。
- 双眼鏡の下で皮質の準備を行います。2つの細い鉗子を使用して、首から目の高さに向かって、正中線で頭蓋骨から背側の皮膚を取り除きます。その後、頭蓋骨の下には脳とその血管が見えます。
- 一対の鉗子で頭を吻側の端に固定し、後端から始めて頭蓋骨の正中線を切開します。次に、頭蓋骨の右半分と左半分を切り取り、脳を露出させます。
- 鉗子の先端を閉じ、脳の下に腹側に配置します。頭蓋骨から脳を持ち上げ、HBSSで満たされた10cmのシャーレに移します。残りの標本についても同じように進めて、すべての脳が皿に集められるまで進めます。
- 脳を採取した後、ハサミのように一対の鉗子を使用して後脳をつまむことにより、皮質の分離から始めます。1対の鉗子で2つの半球の間に正中線切開を行います。鉗子で脳を慎重に固定し、2番目の鉗子を使用して中脳と嗅球を切り取り、皮質の半分になります。
- 皮質の半分を1対の鉗子で固定し、髄膜を横方向の縁から切り離し、続いて2番目の鉗子を使用して皮質表面から髄膜を引っ張ることにより、半球から髄膜を剥がします。
- 皮質の半分を表面を皿に向けて裏返し、三日月形の海馬を1対の鉗子で慎重に解剖し、取り除きます。1つの閉じた鉗子を使用して、単一の皮質を円錐形の15mLチューブに移し、個々の皮質を運びます。
- すべての皮質を収集した後、滅菌層流フードに移動し、皮質組織の解離の準備を開始します。
- 1 mL DMEM を 2 mL 反応チューブに添加し、0.1% w/v パパイン(30 ユニット)を添加します。懸濁液を37°Cの水浴中で清澄化された溶液が生成されるまでインキュベートします(約3分)。0.24 mg/mL L-システインと 20 μg/mL DNAse を加え、穏やかに振
注:消化には、約1mLの酵素溶液が必要です。
- 皮質組織に添加する前に、1 mLの滅菌溶液を得るために(0.22 μmの孔径)フィルターをかけます。チューブを37°Cで30分〜1時間インキュベートします(つまり、水浴中)。
注:ステップ1.11〜1.14は重要であり、15分以内に完了する必要があります。
- 消化反応を終了するには、1 mLのアストロサイト培地を添加し、1 mLのピペットを使用して消化した組織を慎重に粉砕します。トリチュレーションでは、ピペットプランジャーを静かに動かし、皮質組織懸濁液を吸引して押し出します。
- 組織が単一細胞懸濁液に解離したら、5 mLのアストロサイト培地を加え、216 x gで5分間遠心分離します。
- 得られたペレットから上清を慎重に吸引し、細胞を1 mLのアストロサイト培地に再懸濁します。
- 細胞懸濁液を、9 mLのアストロサイト培地(1.2を参照)を補充したT75フラスコに加えます。
- 細胞をインキュベーター内で37°C、6% v/v CO2の存在下でインキュベートします。4日後、最初の完全な培地交換(10 mL)を行います。その後、2〜3日ごとに培地を交換してください。
- 7日後、細胞がコンフルエント単層を形成しているかどうかを確認します。そうでない場合は、培養物が完全に合流するまでさらに2〜3日待ちます
注:アストロサイトは、大きくて平らな細胞体を示し、フラスコの底に局在し、顕著な細胞プロセスを発達させません。それらは、単層の上に存在する小さな位相コントラストの明るい前駆細胞やミクログリアとは異なります。
- 前駆細胞を取り除き、純粋なアストロサイト培養物を得るためには、T75フラスコをオービタルシェーカーに置き、培養物O/Nを250rpmで振とうします。温度が37°Cに調整されていること、およびフラスコのフィルターがCO 2の蒸発を防ぐために実験室用フィルムで密封されていることを確認してください。
- 翌日、培地を吸引し、20 μM のシトシン-1-β-D-アラビノフラノシド (AraC) を補充した 10 mL の新鮮培地を加えて、残存する分裂細胞を除去します。
注:インキュベーター内で37°C、6%CO2のAraCを2〜3日間インキュベートすると、純粋なアストロサイト培養が得られます。
- 光学顕微鏡下での目視検査により、アストロサイト培養物の純度をモニターします。残存する位相差のある明るい前駆細胞とミクログリアがまだアストロサイト単層の上に存在する場合(ステップ1.16を参照)、ステップ1.18と1.19.
を繰り返します。
注:コンフルエントおよび純粋なアストロサイト単層は、インキュベーター内で最大14日間維持できます(37°C、6%v / v CO2)後、次のステップに進むことができます。3 dごとに媒体の半分を交換します。アストロサイトは、保管手順によってニューロンの支持特性を失うため、アストロサイトを収集し、凍結、解凍しないでください。
2. 間接共培養のためのアストロサイトの準備
>注:ニューロンを準備する48〜72時間前に、アストロサイトを細胞培養インサートに移します。一般に、1つのT75フラスコは、1つの調製物で得られたニューロン培養を支えるのに十分な数の細胞を送達します。
- 必要な数のインサートを24ウェルプレートにセットします。各インサートに10 μg/mL PDL(細胞培養グレードの水に溶解)を37°C、6% v/v CO2で約1時間コーティングします。インキュベーション後、インサートをPBSで2回洗浄します。その間に、アストロサイトの準備を進めてください。
注:PBSで満たされたインサートは、アストロサイト細胞懸濁液が使用できるようになるまで保持できます。
- アストロサイト培地(AraC)を吸引し、培養物を10mLのPBSで1回洗浄して、残留血清が除去されるようにします。
- 0.05%トリプシン-EDTA(エチレンジアミン四酢酸)を3 mLフラスコに加え、細胞をトリプシン化のために37°C、6%v/v CO2で約10分間インキュベー
トします。
- 顕微鏡を用いた目視検査により細胞の剥離を制御し、フラスコの側面を卓上に叩くことで細胞の剥離を容易にする
注:ステップ2.5〜2.8は重要であり、15〜20分以内に完了する必要があります。
- トリプシン処理後、細胞を7 mLのアストロサイト培地に穏やかに再懸濁し、細胞懸濁液を15 mLのチューブに移します。216 x gで5分間遠心分離します。
- 上清を慎重に吸引し、細胞ペレットを1 mLのアストロサイト培地に再懸濁します。
- 計数チャンバーを使用して細胞をカウントします。
- 24ウェルプレートのウェルの底部に500 μLのアストロサイト培地を充填し、500 μLのアストロサイト培地中の25,000個の細胞を各インサートに移します。培養物を37°C、6%v/v CO2><でインキュベートします。
注:42〜72時間後、培養物は約100%の合流点に達します。この段階では、培養物の純度を免疫細胞化学によって検証できます。コンフルエントカルチャーは、次のステップに進むまで最大 7 日間維持できます。媒体の半分を3日ごとに交換します。
3. 初代海馬ニューロンの準備
>注:初代マウス海馬ニューロンは、時限妊娠マウスのE15.5 - E16胚に由来するべきです。
- ニューロン培地(10 mMピルビン酸ナトリウム、0.1%w / vオボアルブミン、2%v / v B27培地サプリメント、および0.1% v / vゲンタマイシン(滅菌ろ過)を含むMEM)、および調製培地(0.6%w / vグルコースおよび10mM HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)を含むHBSS)を準備します。フィルターフラスコ内のニューロン媒体を37°C、6%v / v CO2で予温し、事前に平衡化します。
- ガラスカバースリップ(直径12 mm)を24ウェルプレートのウェルに入れます(細胞培養インサートで使用するための切り欠きがある特別なカバースリップを使用してください)。
- 15 μg/mL Poly-DL-Ornithineを水(細胞培養グレード)に37°Cで少なくとも1時間コーティングし、カバースリップが完全に覆われていることを確認するために、ウェルあたり少なくとも500 μLを使用してください。PBSでウェルを2回洗います。PBSをウェルに残して、セルをプレーティングします。井戸が乾かないようにしてください。
- 海馬を解剖するには、調製培地で満たされた3x 10 cm皿と1mL調製培地で1x 2 mLチューブを準備します。ハサミと細い鉗子2本を用意します。
- 子宮頸部脱臼で妊娠中のマウスを犠牲にし、70%v / vエタノールで洗って腹部を滅菌し、鋭利なハサミを使用して腹部を開きます。ビーズ状の子宮をハサミで慎重に切除し、臓器を調製培地で満たされた1x 10cm皿に移します。
- 次に、子宮から胚を取り出します。子宮を慎重に切開し、2つの鉗子を使用して胚を傷つけずに羊膜を取り除きます。その後、ハサミで各胚の首を切り落とし、調製培地が供給された2番目の10cm皿に頭を移します。
- ヘッドの準備を進めます(1.4 - 1.7で説明した準備と同様)。
- 一対の鉗子で頭を固定し、神経軸に垂直な後脳に近い首の領域で頭蓋骨と皮膚を切開します。2組目の鉗子を使用して頭蓋骨と覆う皮膚の両方を持ち上げ、柔らかい頭蓋骨キャップを頭の吻側端に向かって曲げて、脳を露出させます。
- 2つの鉗子の助けを借りて、脳を頭蓋腔から切り離します。これを行うには、1対の鉗子を閉じ、嗅球から始めて後脳に向かって脳を頭蓋骨から分離します。準備用メディウムで満たされた別の10cmの皿に脳を集めます。
- アストロサイトの準備のために、上記のように皮質部分から海馬を解剖します(ステップ1.6)。海馬を各半球から取り出し、調製培地で満たされた2mLチューブに集めます。
- 解剖が完了したら、チューブを滅菌層流ベンチに移し、パパインを含む1mLの消化液で海馬組織を消化します。ステップ1.9〜1.10の説明に従って消化液を準備しますが、代わりにMEMを使用します DMEM.
注:ステップ3.9〜3.12は重要であり、10〜15分以内に完了する必要があります。
- 消化終了後、ピペットで優しく吸引し、消化液を慎重に取り出します。
- 海馬をニューロン培地で3回洗浄し、連続して追加し、その後、洗浄サイクルごとに1mLの新鮮な培養培地を慎重に吸引します。細胞懸濁液を遠心分離しないでください。
- 最終洗浄ステップの後、1 mLのニューロン培地で組織を慎重に粉砕します。
- 計数チャンバーとプレートを使用して細胞をカウントし、24ウェルプレート(3.2で言及されたプレート)の1ウェルあたり500μLニューロン培地に35,000個の細胞をカウントします
注:オプションで、細胞アリコートをトリパンブルーで対比染色して、細胞調製物の活力を評価することができます。顕微鏡を使用した目視検査により、めっき密度を制御します(通常、標準の10倍対物レンズの視野あたり90〜110個の細胞)。
- ニューロンをインキュベーターに37°C、6%v/v CO2で1時間置く。
- インキュベーション後、調製したインサート(コンフルエントなアストロサイト単層を播種したもの)をインキュベーターから取り出します(ステップ2.8を参照)。アストロサイト培地を吸引し、500μlの新鮮なニューロン培地と交換することにより、培地を交換します.
注:インサートは、2〜3 DIV(Days In Vitro)後にコンフルエントな星状細胞単層を抱く必要があります。
- アストロサイトを含むインサートを、滅菌鉗子を使用してニューロン培養物を含むウェル(ステップ3.13)に慎重に配置します。
- 得られた間接ニューロン-アストロサイト共培養液をインキュベーター(37 °C、6% v/v CO2.
に戻します
注:これらの条件下では、ニューロンを完全に定義された培地で最大4週間培養できます。媒体の変更は必要ありません。長期間の培養では、24ウェルプレートからの蒸発を減らすために、空のウェルに滅菌水を入れることをお勧めします。
