サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。
1. ラットまたはマウスの脳の解剖
>注:マウスとラットの両方を使用できます。P8より古い動物も使用できますが(P12までテストしました)、髄膜の除去はますます困難になります。さらに、高齢の動物の脳細胞は、組織の解離中に切断する可能性のある複雑なプロセスと接続を形成し、細胞死の増加につながるため、細胞収量と健康が減少します。ここでは皮質調製物について説明しますが、他の脳領域も使用できます。
- 0.05%トリプシン-EDTAを37°Cの水浴に入れます。
- 動物(E19の子犬の場合は妊娠中のラット、またはP0-P8動物の妊娠ラット)をゆっくりと上昇させ、脳を隔離して安楽死させます。次の手順では、滅菌技術が必要です。
- 胚組織を扱う場合は、まず子宮から胚を取り出して胚嚢を開き、すぐにハサミで頭を切り落とします。すべてのヘッドが切断されたら、予冷した解剖媒体に移します。
- 頭を培地に沈めたら、鉗子で皮膚と頭蓋骨(どちらも若い動物では非常に柔らかい)を開き、小脳をつまみます。脳の残りの部分を慎重に持ち上げて頭蓋骨から取り出します。
手記：2〜4個のE19胚は、解剖の日に皿あたり500,000個の細胞で播種された皮質アストロサイトの少なくとも8つの10cm皿に十分な組織を産出します。
- 新生児以上の子犬の場合は、ハサミで頭を切り落とし、後頭部から鼻先まで一直線に皮膚を内側に切って脳を分離します。皮膚を脇に引っ張り、頭蓋骨を左右に慎重に切り、頭蓋骨を持ち上げます。小脳を切り取り、脳の残りの部分を持ち上げて頭蓋骨から取り出します。
手記： 2〜3匹のP0-P8の子犬は、解剖の日に皿あたり500,000細胞で播種された皮質アストロサイトの少なくとも8つの10cm皿に十分な組織を産出します。
- 皮質を根底にある中脳構造から分離します。鉗子を半球間の縦方向の亀裂内に置き、次に鉗子を一方の半球(縦方向の亀裂に垂直)の皮質と中脳構造の間に動かして、各半球を自由につまみます。
- 鉗子を使用して、各半球(およびその海馬)からすべての髄膜を取り除き、次に海馬を分離します。海馬アストロサイトが必要な場合は、氷上に14mLの解剖培地を充填した15mLのチューブに各海馬を移動します。
- 特定の領域が必要な場合は、各半球の皮質からさらに領域を削除します(例:前頭皮質)。アストロサイトの生成に使用する皮質組織を1 mm3以下の断片に切断します。皮質組織のすべての断片を、氷上の解剖培地で満たされた別の15mLチューブに集めます。
2. 組織の消化と解離
- すべての組織片が収集されたら、それらがチューブの底に落ち着くのを待ってから、できるだけ多くの培地を吸引します。
- 血清ピペットを使用して0.05%トリプシン-EDTAを2〜3mL加え、チューブを37°Cの水浴で20分間インキュベートします
手記：すべてのトリプシンEDTAをピペットから迅速に放出して、組織片を混合し、再び沈殿させます。
- トリプシン-EDTAを慎重に吸引し、チューブの底に組織片をできるだけ少ない液体に残します。
- 5 mLの予冷解剖培地を加えて、残りのトリプシン-EDTAを洗い流します。チューブの上部の側面にピペットで固定し、組織片を混合します。
- 解剖媒体を吸引し、組織片をできるだけ少ない液体に残します。この洗浄ステップを予冷した解剖媒体でさらに2回繰り返します。
- 最終洗浄ステップの後、1,000 μLのピペットチップを使用して1 mLのDMEM+(室温まで加温)を加え、気泡を導入せずにピペッティングで上下に組織を粉砕します
手記：気泡の発生は、アストロサイトが非常に敏感な溶液のpHを変化させる可能性があるため、避けることが重要です。
- 100 μmのセルストレーナーを50 mLチューブの開口部に置き、4.5 mLの予冷済みDMEM+でフィルターを事前に湿らせます。
- 1 mLの解離組織懸濁液を細胞ストレーナーにピペットで移し、さらに4.5 mLの予冷済みDMEM+を加えて細胞ストレーナーで細胞を洗浄します。
3. 細胞の継代
- 継代前日に、細胞培養プレートを0.04%PEIでコーティングします。
- 解剖後のin vitro(DIV)7日目に、DMEM+の細胞が入った10cmのディッシュをインキュベーター内の実験用シェーカーに置き、110rpmで6時間シェイクします。
- コーティングされたカバースリップからPEIを脱イオン蒸留水で2回洗い流します。NB+H培地をプレートに加えます(24ウェルプレートの場合はウェルあたり500 μL、6ウェルプレートの場合はウェルあたり2 mL)。インキュベーター内のプレートを37°Cおよび5%CO2で、10cmのディッシュを振とうしている間、または少なくとも30分間、事前に平衡化します。
- 6時間の振とうが終了する20〜30分前に、1x PBS、DMEM+、NB+H、および0.25%トリプシン-EDTAを水浴中で37°Cまで予温します。
- 6時間の振とう後、培養皿をシェーカーから取り出し、すぐに培地(振落したニューロン、オリゴデンドロサイト、ミクログリアを含む)を1皿あたり10mLの予熱した1x PBSと交換します><。
手記： 非アストロサイト細胞が再付着するのを避けるために、剥離した細胞を含む古い培地をすぐに吸引することが重要です。
- PBSを取り外し、皿ごとに3mLの予熱したトリプシン-EDTAを追加します。各ディッシュをインキュベーター内で37°Cおよび5%CO2で4分間インキュベートします
。
- 各ディッシュの3 mLトリプシン-EDTAに5 mLの予熱済みDMEM+を加え、5 mLの血清ピペットを使用してディッシュから細胞をピペットで取り出し、細胞懸濁液を50 mLチューブに回収します
手記：皿の底から直接ピペットで挟みます - 細胞が剥がれると、皿の床がきれいになるはずです。血清はトリプシンを不活性化するため、(DMEM+の代わりに)血清含有培地のみを使用してください。
- 細胞懸濁液を3,220 x g、20°Cで4分間遠心分離します。
- 上清を取り除き、細胞ペレットを予熱したNB+H1 mLに再懸濁します。
4. アストロサイトの最終培養のための細胞プレーティング
- セルを数えます。
- 6ウェルプレート(ウェルあたり2 mLのNB+H培地)でウェルあたり20,000細胞をプレート化するか、24ウェルプレートでウェルあたり5,000細胞(ウェルあたり500 μL NB+H培地)でプレート化します。
- インキュベーター内の細胞培養物は、さらなる処理または分析まで37°Cおよび5%CO2に保ちます。
