ヒト人工多能性幹細胞の微小電極アレイ上のニューロンへの分化

要約

出典:Frega, M., et al., Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、ヒトが誘導した多能性幹細胞(hiPSC)から興奮性皮質ニューロンを生成する方法を示しています。ドキシサイクリン誘導により、hiPSCは神経特異的な転写因子であるニューロゲニン-2を過剰発現します。このプロセスは、特定の培地を使用し、アストロサイトと共培養することにより、シナプス結合を持つニューロンへのhiPSCの分化を促進します。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 6ウェルMEAおよびガラスカバースリップ上のrtTA/Ngn2陽性ヒトiPS細胞とニューロンの鑑別

>注:このプロトコルでは、2つの異なる基板上のrtTA/Ngn2陽性hiPSC、すなわち6ウェルMEA(ウェルごとに9つの記録と1つの参照埋め込みマイクロ電極を持つ6つの独立したウェルで構成されるデバイス)と24ウェルプレートのウェル内のガラスカバースリップを区別するための詳細が提供されます。ただし、このプロトコルは、表面積に応じて上記の値をスケールアップすることにより、より大きな基質(たとえば、12ウェルプレートまたは6ウェルプレートのウェル)に容易に適合させることができます。

1. MEAまたはガラスカバースリップを準備します(0日目と1日目)
   1. 鑑別開始の前日に、製造元の推奨に従ってMEAを滅菌します。
   2. 接着タンパク質ポリ-L-オルニチン(PLO)を滅菌超純水で最終濃度50 μg/mLに希釈します。希釈したPLOを各ウェルに100 μL滴下して、6ウェルMEAの活性電極領域をコーティングします。滅菌ピンセットを使用して、カバースリップを24ウェルプレートのウェルに置きます。希釈したPLOを各ウェルに800μL加えます。カバースリップが浮かぶのを防ぐには、1000μLのピペットチップでカバースリップを押し下げます。
   3. 6ウェルMEAと24ウェルプレートO/Nを、雰囲気5% CO₂の加湿37°Cインキュベーターでインキュベートします。翌日、希釈したPLOを吸引します。6ウェルMEAのガラス表面とカバースリップを滅菌超純水で2回洗浄します。
   4. ラミニンを冷冷DMEM/F12で希釈し、最終濃度を20 μg/mL(6ウェルMEAの場合)および10 μg/mL(ガラスカバースリップの場合)にします。6ウェルMEAのアクティブ電極領域を直ちに、各ウェルに100μLの液滴を配置してコーティングします。同様に、希釈したラミニンを24ウェルプレートの各ウェルに400 μL加えて、カバースリップをコーティングします。カバーガラスが浮くのを防ぐには、1,000μLのピペットチップでカバーガラスを押し下げます。
   5. 6ウェルMEAと24ウェルプレートを加湿した37°Cインキュベーターで、雰囲気5%_CO2で少なくとも2時間インキュベー
   トします。
2. iPSCのプレート(1日目)
   注:ステップ3.2.1〜3.2.4に記載されているボリュームは、rtTA/Ngn2陽性のhiPSCが6ウェルプレートで培養され、1つのウェルの細胞が回収されることを前提としています。6ウェルMEAおよび/またはカバースリップにセルをプレーティングするために必要な容量は、実験で使用される6ウェルMEAの数および/またはカバースリップの数によって異なります。ステップ 3.2.6 から 3.2.8 で指定した数値を使用すると、さまざまな実験サイズにスケーリングできます。
   1. DMEM/F12、CDS、E8培地を1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンでR / Tに温め、最終濃度4μg / mLにドキシサイクリンを加え、E8培地にROCK阻害剤を加えます。
   2. rtTA/Ngn2陽性のhiPS細胞の使用済み培地を吸引し、1mLのCDSをhiPS細胞に加えます。加湿した37°Cインキュベーターで、雰囲気5%CO₂の3〜5分間インキュベートします。顕微鏡で細胞が互いに剥離しているかどうかを確認します。
   3. ウェルに2 mLのDMEM/F12を加え、1,000 μLのピペットで細胞を穏やかに懸濁し、細胞を15 mLのチューブに移します。7 mLのDMEM/F12を細胞懸濁液に加えます。細胞を200 x gで5分間回転させます。
   4. 上清を吸引し、調製したE8培地を2mL加えます。1,000 μLピペットの先端を15 mLチューブの側面に当て、細胞を穏やかに再懸濁して、hiPSCを解離します。顕微鏡で細胞が解離しているかどうかを確認します。
   5. 血球計算盤チャンバーを使用して細胞数(細胞数/ mL)を決定します.
      手記：80 - 90% のコンフルエント度の 6 ウェルプレートウェルでは、通常、合計で 3.0 - 4.0 x 10^{の 6} 細胞が得られます。
   6. 希釈したラミニンを吸引します。6ウェルMEAの場合、細胞を希釈して7.5 x 10⁵細胞/mLの細胞懸濁液を得ます。6ウェルMEAの各ウェルの活性電極領域に100μLの細胞懸濁液を滴下して、細胞をプレート化します。カバースリップについては、細胞を希釈して4.0 x 10⁴細胞/mLの細胞懸濁液を得ます。500 μLの細胞懸濁液を24ウェルプレートのウェルに添加して、細胞をプレート化します。
      手記：MEAの最終的なセル密度は、カバースリップよりも高くなっています(図1AおよびB)。この高いセル密度は、ネットワーク活動を適切に記録するために必要であることがわかりました。プロトコルでは、アッセイに最適な数値が提供されます。
   7. 6ウェルMEAと24ウェルプレートを、雰囲気5% CO₂で2時間(MEAs)またはO/N(24ウェルプレート)の加湿した37°Cインキュベーターに入れます。
   8. 2時間後、調製したE8培地500μLを6ウェルMEAの各ウェルに慎重に加え、6ウェルMEAs O/Nを5%_CO2の雰囲気の加湿37°Cインキュベーターに入れます。
3. 媒体を変更する(2日目)
   1. 翌日、1%(v / v)N-2サプリメント、1%(v / v)非必須アミノ酸、および1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM / F12を調製します。ヒト組換えニューロトロフィン-3(NT-3)を最終濃度10 ng/mLに、ヒト組換え脳由来神経栄養因子(BDNF)を最終濃度10 ng/mLに、ドキシサイクリンを最終濃度4 μg/mLに添加します。中火を37°Cまで温めます。
   2. ラミニンを最終濃度0.2 μg/mLまで培地に加えます。得られた培地をフィルタリングします。6ウェルMEAと24ウェルプレートのウェルから使用済み培地を吸引し、調製した培地と交換します。6ウェルMEAと24ウェルプレートO/Nを、雰囲気5% CO₂の加湿37°Cインキュベーターでインキュベートします。
4. ラットアストロサイトを追加(3日目)
   注:このプロトコルに記載されているボリュームは、ラットアストロサイトがT75培養フラスコで培養されることを前提としています。培養物に添加されるラットの星状細胞が良質であることが重要です。ラットの星状細胞の品質が良いかどうかを確認するために、2つの基準を使用します。まず、ラットのアストロサイト培養物は、ラットの胚の脳からの分離後10日以内にコンフルエントに成長できるはずです。次に、ラット星状細胞培養物を分割した後、ラット星状細胞は、コンフルエントでテッセレーションされた単層を形成できるはずです(図1C)。ラットのアストロサイト培養物がこれら2つの基準を満たさない場合は、この培養物を分化実験に使用しないことをお勧めします。
   1. 0.05%トリプシン-EDTAをRTまで温めます DPBSとDMEM/F12を1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンで37°Cまで温めます。
   2. ラット星状細胞培養の使用済み培地を吸引します。5mLのDPBSを加えて培養物を洗浄し、優しく振り回します。
   3. DPBSを吸引し、5mLの0.05%トリプシン-EDTAを追加します。.トリプシン-EDTAを優しく振ります。加湿した37°Cインキュベーターで、雰囲気5% CO₂で5〜10分間インキュベー
   トします。
   4. 顕微鏡で細胞が剥がれているか確認してください。フラスコを数回叩いて、最後のセルを切り離します。
   5. 5 mLのDMEM / F12をフラスコに加えます。.10mLピペットでフラスコ内の細胞を穏やかに粉砕します。細胞懸濁液を15mLのチューブに集めます。チューブを200 x gで8分間回転させます。
   6. 上清を吸引し、細胞を1 mLのDMEM/F12に再懸濁します。血球計算盤チャンバーを使用して細胞数(細胞/ mL)を決定します。
   7. 6ウェルMEAのウェルあたり7.5 x 10⁴個のアストロサイトを添加し、24ウェルプレートのウェルあたり2.0 x 10⁴個のアストロサイトを添加します。MEAと24ウェルプレートO/Nを、雰囲気5% CO₂の加湿37°Cインキュベーターでインキュベートします。
5. 媒体を変更する(4日目)
   1. 2%(v / v)B-27サプリメント、1%(v / v)L-アラニル-L-グルタミン、および1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンを含む神経基礎培地を調製します。NT-3を最終濃度10 ng/mLに、BDNFを最終濃度10 ng/mLに、ドキシサイクリンを最終濃度4 μg/mLに添加します。さらに、シトシンβ-D-アラビノフラノシドを2μM.
      の濃度まで添加します。 注:シトシンβ-D-アラビノフラノシドを培地に添加して、アストロサイトの増殖を阻害し、ニューロンに分化していない残りのhiPSCを殺します。
   2. 培地をろ過し、37°Cに温めます。6ウェルMEAと24ウェルプレートのウェルから使用済み培地を吸引し、調製した培地と交換します。6ウェルMEAと24ウェルプレートを、雰囲気5%_CO2の加湿37°Cインキュベーターで維持します。
6. ミディアムをリフレッシュします(6日目から28日目)
   注:6日目から、2日ごとに媒体の半分を更新します。10日目以降、培地にはFBSが補充され、アストロサイトの生存率をサポートします。
   1. 2%(v / v)B-27サプリメント、1%(v / v)L-アラニル-L-グルタミン、および1%(v / v)ペニシリン/ストレプトマイシンを含む神経基礎培地を調製します。NT-3を最終濃度10 ng/mLに、BDNFを最終濃度10 ng/mLに、ドキシサイクリンを最終濃度4 μg/mLに添加します。10日目以降は、培地に2.5%(v / v)のFBSも補給します。得られた培地をろ過し、37°Cに温めます。
   2. 1000 μLピペットを使用して、6ウェルMEAと24ウェルプレートのウェルから使用済み培地の半分を取り出し、調製した培地と交換します。6ウェルMEAと24ウェルプレートを、雰囲気5%_CO2の加湿37°Cインキュベーターで維持します。

結果

図1:hiPSCのニューロンへの分化。ある。hiPSCの3つの時点がカバースリップ上のニューロンに分化します。B. MEAs. C. T75フラスコで100%コンフルエントな状態でのアストロサイトへのhiPSCのプレーティング(細胞がテッセレーションされた単層を形成することに注意)。スケールバー:150μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
B-27サプリメント	ギブコ	0080085SA
Ca2+/Mg2+フリーHBSS	ギブコ	14175-095
0.05 % トリプシン-EDTA	ギブコ	〒25300-054
2.5 % トリプシン	ギブコ	15090-046
高グルコースDMEM	ギブコ	11965-092
FBSの	シグマ・アルドリッチ	F2442-500ミリリットル
ペニシリン/ストレプトマイシン	シグマ・アルドリッチ	P4333
70 μmセルストレーナー	BDファルコン	352350
DPBSの	ギブコ	14190から094
基底膜マトリックス	ギブコ	A1413201
DMEM/F12	ギブコ	11320-074
細胞剥離ソリューション	シグマ・アルドリッチ	A6964の
E8ミディアム	ギブコ	A1517001
ROCK阻害剤	ギブコ	A2644501	あるいは、チアゾビビンのようなROCK阻害剤を使用することもできます。
6ウェルMEA	マルチチャンネルシステム	60-6wellMEA200/30iR-Ti-TCR
ガラスカバースリップ	VWRの	〒631-0899
ポリ-L-オルニチン	シグマ・アルドリッチ	P3655-10MG
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	L2020-1MG
ドキシサイクリン	シグマ・アルドリッチ	D9891-5G
N-2サプリメント	ギブコ	17502-048
非必須アミノ酸	シグマ・アルドリッチ	M7145
NT-3、ヒト組換え体	プロモカイン	C66425
BDNF、ヒト組換え体	プロモカイン	C66212
トリプシン-EDTA	ギブコ	〒25300-054
神経基礎媒体	ギブコ	21103-049
シトシンβ-D-アラビノフラノシド	シグマ・アルドリッチ	C1768-100MG