$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 吊り下げ培養としてのニューロンボールの調製 (Days in vitro (DIV) 0-3)
>注:ここで説明するニューロンボール培養の準備手順は、佐々木グループが以前に報告した方法に基づいており、いくつかの変更が加えられています。また、バンカー法のいくつかの手続きを解離文化に採用しました。
- 解剖を開始する前に、以下の点を確認してください。
- 必要な溶液をすべて調製し、事前にオートクレーブ/ろ過で滅菌してください。
- この皮質ニューロン培養の各ステップで使用するすべての器具と材料を準備しておいてください。
- 層流エアフローキャビネット、解剖台、実体顕微鏡のステージプレート、はさみ、鉗子に70%エタノールをスプレーして拭きます。
- CO2の適用時にマウスを安楽死させ、腹部を解剖してE16胚を取得します。
- 鉗子の細い先端の助けを借りて胚から脳を慎重に取り出し、4 mLの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸、HEPES緩衝塩溶液(HBSS)を含む60 mm細胞培養皿に移します。
手記：解剖媒体HBSSには、10 mM HEPES(pH 7.4)、140 mM塩化ナトリウム(NaCl)、5.4 mM塩化カリウム(KCl)、1.09 mMリン酸二ナトリウム(Na2HPO4)、1.1 mMリン酸二水素カリウム(KH2PO4)、5.6 mM D-グルコース、および5.64 μMフェノールレッドが含まれています。
- 頭皮を切除し、嗅球を切断し、実体顕微鏡下で鉗子の細い先端を使用して各大脳半球から皮質を分離し、新鮮なHBSSを含む別の60mm皿に移します。各別々のニューロンボール培養物に対して少なくとも3〜5個の胚を使用してください。
- 層流細胞培養フード内のマイクロダイセッシングスプリングハサミで皮質を細かく切断します。
- みじん切りにした皮質を15mLチューブに移し、37°C.
の水浴で4mLのHBSS中の0.125%トリプシン4mLでみじん切りにした皮質をトリプシン化します
手記：このトリプシン化時間は、時間の増加(>4.5分)によりより多くのニューロンが死滅するため、効率的なニューロン培養にとって重要です。
- 滅菌トランスファーピペットで細胞凝集体を10 mLのHBSSが入った新しい15 mLチューブに移し、37°Cで5分間インキュベートします。
- 細胞凝集体を、GlutaMax、B27サプリメント(NGB培地)、0.01%DNase I、および10%ウマ血清を含む2mLのNeurobasal培地を含む新しい15mLチューブに移します。
- トリプシン化された皮質を、ファイヤーポリッシュされた細かいガラスパスツールピペットを使用して、ピペッティングを繰り返し上下(3〜5回)することにより、トリプシン化皮質を粉砕します。
手記：ファイヤーポリッシュされたファインガラスパスツールピペットの直径は、バンカーメソッドの論文で説明されているように非常に重要です。ピペットが狭すぎて皮質を通過できない場合は、2〜3種類のサイズのピペットを用意し、より大きなピペットから試してください。
- ニューロンボールを調製するには、上記の細胞懸濁液を取り、NGB培地を使用して細胞密度を1 x 106細胞/mLに調整します。
- 皮質ニューロンを、10cm培養皿の上まぶた内に10,000細胞/滴(1滴は10μL)を含む垂れ下がった滴として培養します。
- 培養皿の底部に7 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加え、加湿条件下で5%CO2を含む37°Cのインキュベーターに3日間保管して、ニューロンボールの形成を可能にします。