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1. 解離した成人後根神経節ニューロンまたはDRGニューロンの培養調製
- 培養物を設定する前に、6ウェルプレートにポリ-D-リジンとラミニンをプレコートします。0.01%ポリD-リジンを含む6ウェルプレートを37°Cで2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。次に、プレートを蒸留水で2回洗います。
- プレートを3 μg/mLの濃度のラミニン溶液と室温で2時間インキュベートし、蒸留水で2回洗浄します。プレートを室温で少なくとも1時間乾燥させます。
- 圧縮されたCO2ガスボンベに接続された透明なCO2チャンバーでマウスを安楽死させます。手術用ブレードで脊柱の上にある皮膚を切開し、傍脊椎筋を両側に解剖して椎骨を露出させます。先端が細い外科用ロンジャーを使用して、DRGが完全に露出するまで椎骨を細心の注意を払って除去します。
手記：成体DRGニューロンは、8週齢から12週齢の成体C57BL6雄マウスから得られます。
解- 剖顕微鏡下で虹彩切除ハサミと先端の細い鉗子を使用して、S1からC1レベルまでDRGを両側から取り外します。シュワン細胞や線維芽細胞の汚染を最小限に抑えるために、DRGから根を完全に切り取るようにしてください。
- 解剖したDRGを、5mLの冷たいダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)が入った60mmのシャーレに氷上に保存します。ただし、DRGがまだ残っている場合でも、すべてのDRGが次のステップになるまで<>
手記：DRGをできるだけ早く分析することが重要です。安楽死後30分30分後に1匹のマウスからすべてのDRGを採取するには、DRGの採取を中止し、カットオフエンド付きの青色ピペットチップ(1000μL)を使用してDRGを1.5mLのエッペンドルフチューブに移すに進みます。ミニ遠心分離機を使用して数秒間すばやく回転させた後、DMEMを取り外してください。125 U/mL XI型コラゲナーゼを含むDMEM1 mLを添加し、37°Cインキュベーターでツイスターシェーカーを使用してチューブを緩やかに回転(35-40 rpm)して90分間インキュベートします。テープを使用してチューブをシェーカーフロアに固定します。
- コラゲナーゼ含有DMEMを廃棄し、新鮮なDMEM1 mLを加えます。浮遊DRGが完全に底に沈むまで待ってから、組織の破片と一緒にDMEMを取り外してください。この洗浄ステップを少なくとも6回繰り返します.
手記：上清を完全に捨てようとしないでください。上清DMEMでDRGを取り除かないように注意してください。
- カットオフエンド付きの青色ピペットチップ(1000μL)を使用して、DRGを15mLコニカルチューブに移します。次に、青色のチップ(1000 μL)を使用して少なくとも15回、ピペットで静かに上下させ、均質な細胞懸濁液を作製します。泡を作らないようにし、ピペットの先端で円錐形のチューブの底に触れないようにしてください。
- チューブを239 x gで3分間遠心分離し、浮遊破片のある上清を慎重に廃棄します。B27(2.0%v / v)を添加したNeurobasal培地1 mLを添加し、5〜10回ピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液を、50 mLのコニカルチューブの上に重ねた70 μmのセルストレーナーに通します。2分間待ってから、ピペットコントローラーを使用してNeurobasal / B-27培地をストレーナーに注ぎます。
- 収集したすべてのDRGニューロン(1匹のマウスから約2 x 106個のDRGニューロン)を6ウェルプレートの2つのウェルにプレートします。1匹の成体マウスのDRGニューロンは、6ウェルプレートで2つのウェルをカバーします。次に、プレートを37°CのCO2インキュベーターに置き、マクロファージが共培養
するまで待ちます。
2. 細胞培養インサート上での初代腹膜マクロファージの共培養
>注:解離したDRGニューロンの最初のプレーティングの4時間後に共培養を確立します
- 一次腹膜マクロファージは、8週齢から12週齢の成体C57BL6雄マウスから調製されます。CO2チャンバーで動物を安楽死させます。腹部の皮膚を繊細に切開し、腹膜を露出させ、腹膜を切らないようにして洗浄液の漏れを防ぎます。
- 22Gの針が付いた注射器を使用して腹膜に穴を開け、10mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を腹腔に注入します。腹膜を1〜2分間優しくマッサージします。次に、針を引き出し、針穿刺部位からPBSを絞り出し、洗浄液を50mLの円錐管に集めます
手記： 使用する前に、PBSの冷たさを保つためにシリンジを氷の上に置いてください。
- 洗浄液を239 x gで4°Cで10分間遠心分離し、細胞成分をペレット化します。ペレットを赤血球(RBC)溶解緩衝液3 mLで室温で3分間再懸濁します。次に、細胞懸濁液を再び239 x gで4°Cで10分間遠心分離します。ペレットを3 mLのPBSで再懸濁し、細胞懸濁液を再度遠心分離して、残っているRBC溶解バッファーを除去します。
手記： RBC溶解バッファーが完全に除去されていることを確認してください。そうしないと、残っているRBC溶解バッファーが培養マクロファージに対して有毒になる可能性があります。
- ペレット化した細胞を1 mLのNeurobasal/B-27培地に再懸濁します。回収したマクロファージ全体(合計3個×106〜6×106個の細胞)の半分を、有効面積4.2cm2の細胞培養インサートにプレート化し、解離したDRGのウェルの上に置く
手記： 共培養期間中、マクロファージはNeurobasal/B-27ニューロン培養培地で増殖します。この条件下でのマクロファージの十分な生存が確認されました。
3. db-cAMP(ジブチリル環状AMP)の治療とマクロファージCMの採取
>注:ニューロン-マクロファージ共培養の4時間後にdb-cAMP治療を開始します。
- 2 μL の 100 μM db-cAMP 溶液をニューロン-マクロファージ共培養液に加えます。対照実験に同量のPBSを追加します。
- 24時間後、同じ6ウェルプレートに1 mLのマクロファージ培養培地を空のウェルに充填します。ニューロン-マクロファージ共培養物中の細胞培養インサートを、マクロファージ培養培地を用いて空のウェルに移します。培地を変更せずに、細胞を同じ条件で72時間保持します。
手記： CMの採取時にマクロファージ培地を1 mLだけ加えて、濃縮されたCMを作製します。CMコレクションでは、必要に応じて、インサート内のマクロファージを完全に覆うためにさらに追加しました。
- 72時間後、マクロファージCMを239 x gで5分間遠心分離し、細胞成分を除去します。上清を0.2μmのフィルターに通し、残っている細胞の破片を取り除きます。収集したCMは、使用するまで-70°Cで保管してください。