マクロファージ馴染培地を用いたニューロン伸長の促進

要約

出典:Yun, H. J., et al. Neuron-Macrophage Co-cultures to Activate Macrophages Secreting Molecular Factors with Neurite Outgrowth Activity. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオは、マクロファージで調整された培地を使用して、神経突起伸長として知られるニューロン突起の成長を促進するためのアッセイを示しています。ニューロンとマクロファージをcAMPで共培養し、マクロファージ由来のコンディショニング培地を回収します。条件付けされた培地でニューロンを成長させると、神経突起の成長が促進されます。これらの成長物は蛍光標識され、蛍光顕微鏡を使用して視覚化されます。

プロトコル

>1. Db-Campの処置とマクロファージ馴化培地の採取

>注:ニューロン-マクロファージ共培養の4時間後にdb-cAMP治療を開始してください。

1. 2 μL の 100 μM ジブチリルサイクリック AMP (db-cAMP) 溶液をニューロン-マクロファージ共培養液に加えます。対照実験のために、同量のリン酸緩衝サリン(PBS)を添加します。
2. 24時間後、同じ6ウェルプレートに1 mLのマクロファージ培養培地を空のウェルに充填します。ニューロン-マクロファージ共培養物中の細胞培養インサートを、マクロファージ培養培地と共に空のウェルに移します。培地を変更せずに、細胞を同じ条件で72時間保持します.
   手記：コンディショニング培地(CM)の採取中に1 mLのマクロファージ培養培地のみを加えて、濃縮されたCMを作成します。CMコレクションでは、必要に応じて、インサート内のマクロファージを完全に覆うためにさらに追加しました。
3. 72時間後、マクロファージCMを239 x gで5分間遠心分離し、細胞成分を除去します。上清を0.2μmのフィルターに通し、残っている細胞の破片を取り除きます。収集したCMは、使用するまで-70°Cで保管してください。

2. CMを採取した神経突起伸長アッセイ

1. 別の成体DRGニューロン培養物を設定する前に、8ウェルチャンバースライドにポリ-D-リジンとラミニンを事前にコーティングします。0.01%ポリD-リジンを含む6ウェルプレートを37°Cで2時間、または4°Cで一晩インキュベートします。次に、プレートを蒸留水で2回洗います。
2. プレートを3 μg/mLの濃度のラミニン溶液と室温で2時間インキュベートし、蒸留水で2回洗浄します。プレートを室温で少なくとも1時間乾燥させます。
3. B27を添加した神経基礎培地で解離した成体DRGニューロンを取得します。5 x 10⁴セル/ウェルをプレコートされた8ウェルチャンバースライドにプレートします。
4. チャンバースライドを37°Cのインキュベーターに2時間置き、細胞が底部に付着するまで待ちます。次に、37°Cに予熱した解凍したCMに培地を交換します
   手記：培地を取り出して回収したCMを添加する際は、8ウェルチャンバースライドの底部に触れないように注意してください。
5. 最初のめっきから15時間後、培地を取り出し、細胞をPBSで一度洗浄します。次に、氷冷した4%パラホルムアルデヒド溶液200μLをウェルに加え、パラホルムアルデヒド溶液と細胞を4°C
   で20分間インキュベートします 手記：神経突起伸長アッセイのためのDRGニューロン培養は、正確に15時間に制限する必要があります。この条件下では、目立った神経突起の成長はありません。
6. 氷冷PBSで3回洗浄した後、10%正常ヤギ血清(NGS)と0.1% Triton-Xでブロッキングを30分間行い、固定細胞を10%NGS(1μg/mLの濃度)で希釈した一次抗体(抗Tuj-1)溶液で室温で4時間または4°Cで一晩インキュベートします。
7. PBSで3回洗浄した後、細胞を二次抗体(ヤギ抗マウス)溶液と室温で2時間インキュベートします。その後、PBSで2回洗浄し、埋込液を用いてカバースリップ(24×50mm)で培養スライドを埋込します。
8. 蛍光顕微鏡を使用して画像を撮影し、神経突起の伸長を視覚化します(図1)。

結果

図1:さまざまな条件から得られた馴化培地を使用した神経突起伸長アッセイの代表的な結果。(A、B)成体DRGニューロンを急性解離し、正確に15時間培養した。めっきの2時間後、培地をPBS(A)またはジブチリルcAMP(db-cAMP)(B)のいずれかで処理したニューロン-マクロファージ共培養物から得られた馴化培地(CM)に置き換えた。db-cAMPで処理したCMのみが、堅固な神経突起伸長活性を示した。(C、D)マクロファージ(C)またはニューロン(D)のみからなる培養物から得られたCMは、db-cAMPで処理され、神経突起伸長をサポートしませんでした。スケールバーは200μmを示します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞培養インサート透明PETメンブレン 孔径0.4μm	コーニング、ファルコン	353090	孔径0.4μmの透明PETメンブレン、6ウェルプレート用
70μmナイロンセルストレーナー	コーニング、ファルコン	352350
8ウェル培養スライド	バイオコート	354632	Poly-D-Lysineの均一な適用で
神経基礎媒体	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Gibco	21103-049	グルタマックス1%、ペニシリン-ストレプトマイシン1%を含む
B-27サプリメント、無血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Gibco	17504-044	細胞外溶液
グルタマックス	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Gibco	35050-061
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Gibco	15140-122
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩	シグマ・アルドリッチ	P6407-5MG
ラミニン	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Invitrogen	23017-015
アデノシン3'、5'-環状一リン酸、N6、O2'-ジブチリル、ナトリウム塩	メルク・ミリポア・コーポレーション、カルバイオケム	28745
10%ノーマルヤギセラム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16210072
トリトン-X-100	大中化学金属有限公司	〒8566-4405
抗β IIIチューブリン(Tuj-1)	プロメガ株式会社	G7121	マウスモノクローナル抗体
ヤギ抗マウスIgG (H+L) 二次抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック、Invitrogen	A11005 (英語)
血球計算盤	マリエンフェルト・スーペリア	該当なし
細胞培養用CO2インキュベーター	パナソニック	該当なし
卓上遠心分離機	ソルバル	該当なし
共焦点顕微鏡	オリンパスアメリカ株式会社	IX71
FBS(ウシ胎児血清)	VWRインターナショナル、ハイクロン	03 SH30919月