マイクロ流体デバイスを用いた運動ニューロンにおけるオルガネラの軸索輸送の追跡

要約

出典:Altman, T., et al.マイクロ流体チャンバーシステムを使用した運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送。J. Vis. Exp. (2020年)。

このビデオは、マイクロ流体チャンバーシステムを使用して運動ニューロンの軸索輸送を追跡する方法を示しています。これは、ポリマー被覆ウェル内でマウス胚性脊髄組織を栄養培地で培養し、軸索成長を誘導することを含みます。ライブイメージングにおける蛍光色素染色オルガネラの動きは、双方向の軸索輸送を確認します。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マイクロ流体チャンバーまたはMFC調製

1. 一次金型でのPDMS鋳造(図1)
   1. 詳細なプロトコルに従って一次金型(ウェーハ)を購入または作成します。
   2. コーティングステップに進む前に、加圧空気を使用してウェーハプラットフォームからあらゆる種類の汚れを取り除きます。ウェーハの表面は滑らかでクリアに見えるはずです。
   3. 容器に50mLの液体窒素を入れます。10mLの注射器と23Gの針を準備します.
      手記：このステップ以降のすべての手順は、ケミカルフードで実行する必要があります。
   4. ケミカルフードで、シリンジとニードルを使用して2mLの液体窒素をプールします。空気が吸い込まれたように見えますが、シリンジには窒素が充填されています(図1A)。ウェーハ含有プレートを密封可能な容器に入れます。
   5. クロロトリメチルシランボトルをねじで開き、窒素充填シリンジを使用してゴムキャップを貫通し、シリンジの内容物全体をボトルに注入します。針を引き抜かずに、ボトルを逆さまにして、2mLのクロロトリメチルシランを引き戻します><。 手記： シリンジの圧力により、針から少量のクロロトリメチルシランが噴霧されます。危険を避けるために、針をフードの内壁に向けます(図1B)。
   6. クロロトリメチルシランを容器内に均一に広げます(ステップ1.1.4から)が、ウェーハまたはウェーハ含有プレートに直接広げないでください。容器を閉じ、ウェーハあたり5分間インキュベートします.
      手記：ウェーハがクロロトリメチルシランでコーティングされるのが初めての場合は、各ウェーハに1時間のインキュベーションを許可する必要があります。
   7. ウェーハと容器をケミカルフードから30分間取り出さないでください.
      注意：クロロトリメチルシランは揮発性が高いです。
   8. 50 mLチューブ内のPDMSベース(材料表を参照)を秤量し、PDMS硬化剤をそれぞれ16:1の比率で添加します(例:ベース47.05 gと硬化剤2.95 g)。低速ローテーターを使用して10分間混合します。
   9. PDMSを各ウェーハ含有プレートに希望の高さまで注ぎます(図1C).
      手記： 薄いマイクロ流体チャンバー(最大3〜4 mm)を使用すると、培養皿への密着性が向上し、漏れを防ぎます。
   10. すべてのプレートを真空デシケーター内に2時間一緒に置きます(図1E)。これにより、PDMS内に閉じ込められた空気が除去されるため、気泡がなくなり、透明で均一な金型が形成されます。
   11. プレートをオーブン内に3時間(または一晩)70°Cで置きます(図1E).
       手記：プレートはオーブンに入れるときに水平でなければなりません。
2. エポキシ金型でのPDMS鋳造
   手記： ウェーハの準備は高価で、特別な機器が必要であり、壊れやすいウェーハを損傷する可能性があるため、ウェーハのエポキシレプリカを生成することができます。レプリカはより安価で、より耐久性があり、マイクロ流体チャンバーの大量生産に使用できます。
   1. PDMS(1.1.8-1.1.11で説明)を元のウェーハにキャストして硬化させます。
   2. PDMSの余分な部分を取り除き、マイクロ流体要素とそれらをマイクロ流体チャンバーに処理するために必要な機能領域のみを残します。
   3. すぐにPDMSを厚手の粘着テープで包み、ほこりがたまらないようにします。
   4. PDMS全体を内部に収め、周囲にエポキシ樹脂のスペースを残す組織培養グレードのプラスチック皿を選択してください。PDMSからプラスチック皿までの距離は5mm未満である必要があります。
   5. 10:1の割合で混合したPDMSを少量調製します(塩基:硬化剤)。新鮮な液体PDMSは、プラスチックプレートの底に固体PDMSを接着するために使用されます。
   6. プラスチックプレートの中央底部に最小限の液体PDMSを塗布し、PDMSから粘着テープをはがしてプラスチック皿の底に接着します。マイクロ流体要素が上を向いていることを確認してください。
   7. PDMSを70°Cのオーブンで30分間硬化させます。
   8. 試験管内でベースと硬化剤をそれぞれ100:45の割合で混合することにより、エポキシ樹脂を調製します。エポキシ樹脂が異なれば、混合比も異なる場合があります。通常の100mmプレートに必要な容量は約40mLです。
   9. エポキシをローテーターで10分間よく混合し、混合物が目に見えて均一になるまで(つまり、液体中に目に見える繊維のようなアーティファクトがなくなるまで)。
   10. エポキシ混合物を400 x gで5分間遠心分離し、内部に溜まった気泡を取り除きます。
   11. 遠心分離中は、培養皿の壁やその他すべての露出したプラスチック部分の周りにシリコングリースの薄い層を広げます。これにより、エポキシがディッシュプラスチックと重合するのを防ぎ、プロトコルの終了時に硬化したエポキシを簡単に除去することができます。
   12. エポキシ樹脂を皿にゆっくりと注ぎ、PDMSを完全に覆い、少なくとも5 mm超えるまで注ぎます。チューブとプレートの間の距離をゼロに保つことにより、エポキシ樹脂内に気泡が形成されるのを防ぎます。プレートを安全な場所に置いて、次の48時間動かないようにします。
   13. 48時間後、エポキシは完全に硬化するはずです。プレートを80°Cに予熱したオーブンに3時間挿入し、最終硬化させます。
   14. プレートのプラスチック壁を壊れるまでそっと引っ張って、硬化したエポキシをプレートと元のPDMSモールドから取り外します。その後、エポキシから簡単に分離して剥がすことができます。
   15. 抽出したら、新しいエポキシレプリカから残りのグリースを拭き取り、逆さまに(つまり、複製されたマイクロ流体要素を上に向けて)新しい培養皿にはめ込みます。これで、エポキシレプリカをPDMS鋳造する準備が整いました。
   16. 加圧空気またはN2を使用して、PDMSの残りやエポキシ金型の汚れを吹き飛ばし、イソプロパノールで2回すすぎます。3回目に充填し、オービタルシェーカープレート上で10分間インキュベートします。型をイソプロパノールで再度3回すすぎ、残りの液体を捨てます。エアーまたはN2でブロードライするか、乾燥するまで70°Cのオーブンに入れます.
       手記：イソプロパノールを取り扱い、廃棄する際には、安全手順に従ってください。
   17. 鋳造するまで、モールドプレートを閉じたままにしてください。手順1.1.8から1.1.11に従います。
3. PDMSをMFCにパンチングしてスカルプトする(図2)
   1. メスを使用してウェーハの(+)マークをたどり、PDMSモールドをプレートから切断して取り外します。金型は壊れやすいため、力を入れないでください(図2A)。
   2. スケッチに描かれた指示に従って、実験のセットアップに応じてチャンバーをパンチして切断します(図2B-F)。
      1. 脊髄外植片培養(図2C、E)の場合、大きなMFCの遠位側に2つの7 mmウェルを打ち抜きます。ウェルがチャネルの端と重なるようにウェルを配置します。近位側では、チャネルの中央に7 mmの1つをパンチし、オーバーラップを最小限に抑えて、外植片に十分なスペースが残るようにします。近位チャネルの2つの端にさらに2つの1mmの穴を開けます。マイクロ流体エレメントを上に向けてMFCを回転させ、20Gの針を使用して、パンチングされた7mmウェルに3つの小さな外植片の洞窟を彫ります。
      2. 解離MN培養(図2D、F)の場合、小さなMFCの2つのチャネルの端に4つの6 mmウェルを打ち抜きます。
4. MFCの組織培養用滅菌
   1. ベンチに長さ50cmの粘着テープバンドを広げます。チャンバーを押して引き戻し、粘着テープ(上面と下面の両方)に面させ、粗い汚れを取り除きます。クリーンチャンバーを新しい15cmプレートに入れます.
      手記：マイクロ流体要素が上を向いているときは、マイクロ流体要素を直接押さないでください。
   2. 分析グレードの70%エタノールでチャンバーをオービタルシェーカーで10分間インキュベートします。
   3. エタノールを廃棄し、チャンバーを組織培養フードまたは70°Cのオーブンで乾燥させます。
5. MFCをガラス底の皿に置く
   1. チャンバを組織培養グレードの35 mm/50 mmガラス底皿の中央に置き、端に小さな力を加えてPDMSと皿底部を結合させます。ガラスの底が割れないように、常に固体の表面の上に力を加えてください。
   2. 70°Cで10分間インキュベートし、チャンバーを押してプレートへの接着を強化します。
   3. UV光下で10分間インキュベートします。
6. コーティングと培養
   1. 両方のコンパートメントに1.5 ng / mLポリ-L-オルニチン(PLO)を追加します。.PLOがチャネルを通過していることを確認するには、コーティング媒体をチャネル入口で直接数回ピペッティングします。
   2. マイクロ流体チャンバーを10倍の倍率の光学顕微鏡で調べて、気泡の存在を確認します。気泡がマイクログルーブを塞いでいる場合は、MFCを真空デシケーターに2分間置きます。その後、コーティング媒体をチャネルにピペッティングして、チャネルに詰まった余分な空気を取り除きます。一晩インキュベートします。
   3. PLOをラミニン(重水素減少水で3μg/mL)に置き換えて、同じ方法で一晩インキュベーションします。
   4. めっきする前に、ラミニンをニューロン培養液で洗浄します。

2. 神経細胞培養プレーティング

1. 脊髄外植片培養
   1. まっすぐなハサミと細い鉗子を使用して、E12.5 ICR-HB9:GFPマウス胚から脊髄を解剖します。1% ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) を含む 1X HBSS 溶液で作業します (図 3A-C)。
   2. マイクロダイセクションハサミを使用して、髄膜と背角を取り除きます(図3D)。
   3. 脊髄を厚さ1mmの横断部に切断します(図3E)。MFCの近位コンパートメントからすべての媒体を廃棄します。.
   4. ピペットで単体の脊髄外植片をピペットで拾い上げ、できるだけ洞窟の近くに外植片を注入し、近位ウェルから横方向の出口(1mmパンチ)を介して余分な液体を引き出します。外植片は近位チャネルに吸い込まれるべきです。
   5. 150 μLの脊髄外植片培地(SCEX、材料表および表3を参照)を近位ウェルにゆっくりと加えます。
   6. 脊髄外植片培養のメンテナンス
      1. 近位コンパートメントにSCEX培地を追加し、遠位コンパートメントに豊富なSCEX培地(50 ng / mLのBDNFおよびGDNFを含むSCEX)を追加します。遠位ウェル(大容量)と近位ウェルとの間のウェルあたり少なくとも15μLの容量勾配を維持します。
      2. 2日ごとにミディアムを更新します。軸索が遠位に交差するのに最大3〜5日かかる場合があります。

3. 軸索輸送 (図 4A)

1. ミトコンドリアと酸性コンパートメントの標識
   1. 100 nM Mitotracker Deep Red FM と 100 nM LysoTracker Red を含む新しい SCEX 培地(または解離 MN の場合は CNB)を調製します。37°Cで30〜60分間インキュベートします。他の色は、蛍光色素が重ならない限り使用できます。
   2. 温かいCNB / SCEXメディウムで3回洗います。プレートはイメージングの準備ができています。
2. ライブイメージング
   1. 軸索輸送のタイムラプス画像シリーズを3秒間隔で100枚、ムービーごとに合計5分で取得します
      手記： この研究で使用されたイメージングシステムには、独自の細胞イメージングソフトウェアによって制御されるスピニングディスク共焦点を備えた倒立顕微鏡、60倍オイルレンズ、NA = 1.4、およびEMCCDカメラが含まれていました。動画は、37°Cおよび5%CO₂.
      の制御された環境で取得しました 手記：実験に応じて、より長いまたはより短いタイムラプス動画を撮影できます。必要に応じて、夜通しの映画でも録画できます。ただし、露光時間とレーザー出力、および画像の総数を減らすことで、動画撮影中の光毒性と漂白を減らすことが重要です。

結果

図1:シリコーン型の準備。クロロトリメチルシランウェーハ洗浄の手順を説明する概略図。(A)まず、適切な容器に液体窒素50mLを添加した。ケミカルフード内で作業し、シリンジと針を使用して8mLの液体窒素を吸引しました。シリンジの全内容物をクロロトリメチルシランボトルに注入した。キャップを下にしてボトルを回し、8mLのクロロトリメチルシランを引き戻しました。(B)クロロトリメチルシランが容器内に広がります(ウェーハ上に直接広がるわけではありません)。容器を閉じ、その後、各型で5分間インキュベートする必要があります。(C)液体PDMSを各ウェーハに所望の高さまで注ぎ込みました。(D)すべてのプレートを真空デシケーター内に2時間一緒に置き、その後70°Cのオーブンで3時...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35mm Fluodish – ガラス底皿	ワールド精密機器WPI	FD35-100
50mm Fluodish – ガラス底皿	ワールド精密機器WPI	FD5040-100
Andor iXon DU-897EMCCDカメラ	アンドール
ARA-C(シトシンβ-D-アラビノフラノシド)	シグマ・アルドリッチ	C1768	ろ過された重水素水における2mMのストック
B-27 サプリメント (50X)	サーモフィッシャー	17504044
BDNFの	アロモンラボ	B-250	0.01% BSAでろ過した重水溶液中で10 μg/mLに希釈してください。
生検パンチ 1.25mm	ワールド精密機器WPI	504530	大型MFCの準備に
生検パンチ6mm	ワールド精密機器WPI	504533	小型MFCの準備に
生検パンチ7mm	ワールド精密機器WPI	504534	大型MFCの準備に
Bitplane Imarisソフトウェア - バージョン8.4.1	イマリス
ウシ血清アルブミン(BSA)	シグマ・アルドリッチ	#A3311-100G	5% w/v (重水素減少水)
クロロトリメチルシラン	シグマ・アルドリッチ	#386529から100ミリリットル
CNTF	アロモンラボ	C-240	0.01% BSAでろ過した重水溶液中で10 μg/mLに希釈してください。
密度グラジエントメディウム - Optiprep	シグマ・アルドリッチ	D1556
ウシ膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼI(DNAse)	シグマ・アルドリッチ	DN-25	ニューロベースルに10mg / mLをストック
ダウコーニング高真空シリコーングリース	シグマ・アルドリッチ	Z273554-1EA	エポキシ金型の準備に
DPBSの10X	サーモフィッシャー	#14200-067	1:10 in DDW で希釈
デュモンファインフォープレス#55 0.05 × 0.02 mm	F.S.T(エフエスティー)	1125520
エポキシ硬化剤	トリアスケムS.R.L	アイピー743	エポキシ金型の準備に
エポキシ樹脂	トリアスケムS.R.L	RP 026UV	エポキシ金型の準備に
FIJIソフトウェア	イメージJ
GDNFの	アロモンラボ	G-240	0.01% BSAでろ過した重水溶液中で10 μg/mLに希釈してください。
グルタマックス100X	サーモフィッシャー	#35050-038
HB9:GFPマウス系統	ジャクソン研究所	5029
HBSSの10X	サーモフィッシャー	#14185-045	1%P/Sを添加して1:10をddwで希釈し、フィルターを濾過します。
iQソフトウェア	アンドール
アイリスハサミ、湾曲、10 cm	AS Medizintechnik	11-441-10
虹彩はさみ、ストレート、9 cm	AS Medizintechnik	11-440-09
ラミニン	シグマ・アルドリッチ	2020年 #L 月
リーボビッツのL-15ミディアム	サーモフィッシャー	11415064
LysoTracker レッド	サーモフィッシャー	L7528
MitotrackerディープレッドFM	サーモフィッシャー	M22426
神経基礎媒体	サーモフィッシャー	21103049
ニコンエクリプスTiマイクロスコープ	ニコン
ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)溶液	バイオ産業	03-031-1
ポリ-L-オルニチン(PLO)	シグマ・アルドリッチ	#P8638	1:1000をフリッター1X PBSで希釈
Sylgard 184 シリコンエラストマーキット	ダウコーニングコーポレーション	#3097358から1004
バンナススプリングマイクロダイセクションハサミ、3mmブレード	F.S.T(エフエスティー)	15000-00

の します。 名 します。