動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 材料の準備
- 実験を行う前に、オートクレーブを使用してすべての器具とddH2Oを滅菌してください。器具には、手術用ハサミ、眼科用ハサミ、鉗子、スプーン核ディバイダー、ガラス皿(直径60〜100mm)、ガラスビーカーが含まれますが、これらに限定されません。
- クレブス溶液を調製します(表1):使用前にすべての化学物質をddH2Oで溶解します。CaCI2を別々に溶解し、沈殿物を避けるために攪拌しながら混合溶液にゆっくりと加えます。
- 10%ウシ胎児血清(FBS)と1%抗生物質/抗真菌薬(100x)を含むF12培地からなるリンス培地を準備します。5 mLのFBSと0.5 mLの抗生物質/抗真菌薬を44.5 mLのF12培地に加えます。.
- 2% B-27、1% FBS、1% L-グルタミン、1% 抗生物質/抗真菌薬 (100x)、および 0.1% グリア由来神経栄養因子 (GDNF) を含む神経基礎 A 培地を含むニューロン培地 A を調製します。200 μL の B-27、100 μL の FBS、100 μL の L-グルタミン、100 μL の抗生物質/抗真菌薬 (100x)、10 μL の GDNF (10 μg/mL) を 9.5 mL の神経基礎 A 培地に加えます><。
手記：B-27、L-グルタミン、GDNFの鮮度を確保するために、使用後1週間以内にニューロン培地Aを調製してください。
- ニューロンメディアBは、ニューロンメディアAの調製と同じ手順を用いて調製しますが、FBSを添加しません。
- 20 mgのコラゲナーゼII型、6 mgのウシ血清アルブミン、および200 μLの抗生物質/抗真菌薬(100x)を10 mLの酸素安定クレブス溶液に溶解して、消化液1を調製します。
- 消化液2は、0.25%トリプシン1mLをハンクバランス塩溶液4mLで希釈して
調製します。
- カバースリップをコーティングしたプレートを準備します。
- ガラスカバースリップを48ウェル培養プレートに配置するときは、層流ベンチで鉗子を使用します。
- ポリ-D-リジンをddH2Oで0.1 mg/mLの濃度に希釈します。ストックを-20°Cで保存し、解凍する前に解凍
してください
- 各カバーガラスの上に40 μLのポリ-D-リジンストックを加え、溶液を室温で10分間インキュベートします
手記：基底面積が異なるプレートごとに濃度を4 μg/cm2に調整します。例えば、24ウェルプレートの1つのウェルの基底面積が2 cm2の場合、ウェル内のポリ-D-リジンストック80 μLを移す必要があります。各cm2には、4μgのポリ-D-リジンが含まれます。
- 48ウェルプレートのポリ-D-リジンを除去し、カバースリップをddH2Oで3回すすいでください。
- プレートを層流フードで少なくとも30分間乾燥させ、プレートが無水であることを確認します。
- プレートを4°Cで保存してから、ラミニンコーティングを最大1日間保存してください。プレートを-20°Cで保存することは、長期保存に適しています。
- ラミニンを4°Cで解凍し、ラミニンをddH2Oで50μg/mLの濃度に希釈します。ストックは-20°Cで保存し、4°Cで解凍してから使用してください。
- ピペットを使用して、希釈したラミニン100 μLを各カバースリップの上部に移し、ラミニンを4°Cで1時間インキュベートします
手記：濃度を5 μg/cm2に調整し、基底面積が異なるプレートごとに使用します。例えば、24ウェルプレートの1つのウェルの基底面積が2 cm2の場合、200 μLの希釈ラミニンをウェルに移します。各cm2には5μgのラミニンが含まれています。
- ラミニン溶液を取り除き、カバースリップをddH2Oで一度すすいでください。こすり傷を避けるために、カバースリップの端でこの操作を実行してください.
手記：コーティングされたカバーガラスは、最大で2週間4°Cで保存できます。
2. 膀胱の収穫
- 生後5週間のSprague–Dawleyラットを入手します。
- カルボゲン(95%酸素、5%CO2)を氷浴で少なくとも30分間クレブス溶液に注入して、安定した酸素状態とpHレベルに到達します。
- 子宮頸部脱臼による安楽死後、滅菌のためにラットを75%エタノールに30秒間浸します。
- 滅菌した手術用タオルの上にネズミを置き、腹部を露出させます。腹腔を開き、はさみと鉗子のセットで膀胱を明らかにします。
- 膀胱をそっと持ち上げ、別のはさみと鉗子のセットで膀胱を膀胱首から切り取り、相互汚染を防ぎます。膀胱を冷たくて酸素安定性のあるクレブス溶液に急速に入れて、細胞の生存率を改善します。
手記：膀胱を摘出したら、ニューロンの生存の可能性を改善するために、次の手術を迅速に実行します。
- クレブス溶液を3つのガラス皿とガラスビーカーに加えます。
- ガラス皿とビーカーを氷浴でクレブス溶液で予備冷却します。
- これらのコンテナには、混乱を防ぐために、1〜3の番号を付けてください。
- 各ガラス皿を鉗子とスプーン核分割器と組み合わせます。
- ガラス皿1で、眼科用ハサミで膀胱を切り開き、鉗子とスプーン核分割器で広げます。
- ガラスビーカー1で膀胱をすすぎ、ガラス皿2に入れます。
- ガラス皿2の鉗子と眼科用ハサミを使用して、組織表面の付着脂肪を除去します。
- ガラスビーカー2で膀胱をすすぎ、ガラス皿3に入れます。
- 鉗子とスプーンの核仕切りを使用して膀胱をガラス皿3にそっとこすり落とし、外因性の付着物を取り除きます。
- ガラスビーカー3で膀胱をすすぎ、14 mLの冷たいクレブス溶液を入れた15 mLの遠心チューブに膀胱を移し、サンプルを356 x g、4°Cで1分間回転させます。
- クレブス溶液を含む他の2本のチューブで前のステップを2回繰り返して、汚染を減らします。
3. 二段階の膀胱消化
- 膀胱を遠心チューブから1 mLの消化液1が入った2 mLバイアルに移します。眼科用ハサミを使用して、膀胱を溶液中で小片(1 mm未満)に切断します。
- 膀胱溶液を9 mLの消化溶液1と滅菌細胞培養皿(直径100 mm)で混合します。ステップ1の消化は、振とうインキュベーターで5%CO2、37°C、200rpmで1時間行います。
- ステップ1の消化後、溶液を356 x g、4°Cで8分間遠心分離します。
- 消化液2を37°Cのウォーターバスに入れて予熱します。
- 遠心分離後、消化液1を含む上清を取り除き、細胞沈殿物を回収します。多少の残液は許容されます。溶液を完全に除去すると、細胞の喪失が促進される可能性があります。
- 細胞沈殿物を15 mLの遠心分離チューブで温かい消化液2と混合し、37°Cの水浴で5分間消化しながら混合物を振とうします。ステップ2の消化から7分を超えないと、ニューロンが死んでしまいます。
- 消化後、10 mLのコールドリンス培地と混合物中のトリプシンを直ちに不活性化します。
手記：0 °C〜4 °Cで次の手順を実行します。氷風呂はそのような条件を提供することができます。
- 遠心分離後、356 x g、4°C、8分間遠心分離後、細胞沈殿物を回収し、残ったトリプシンが細胞増殖に害を及ぼすため、できるだけ多くの培地を除去します。
- 沈殿物を3 mLのニューロン培地で穏やかに再懸濁します。高い生存率を得るために、細胞を含む溶液中に気泡が発生しないようにしてください。
- 混合物培地を70 μmのセルストレーナーでろ過し、50 mLの遠心チューブに入れます。
- 濾液をシェーカーに30rpmで氷浴で30分間保持します。この手順は必須ではありませんが、推奨されます。
- 356 x g、4°C、8分間の遠心分離により細胞を回収し、細胞ペレットを1 mLのニューロン培地Aに穏やかに再懸濁します。
- 調製した48ウェルプレートの各ウェルに500μLの細胞混合物を加えます。
- インキュベーター内で細胞を37°Cおよび5%CO2で培養します。
- 1時間以内にすべての培地をニューロン培地Bに交換し、無血清培養を行います。
- ニューロンメディアBの半分を3日ごとに交換します.
手記：ニューロンは、培養の5〜7日後に免疫細胞化学実験の準備が整います。
>表 1.クレブス溶液の組成
の
名
名
| ざいりょう | モル濃度(mM) |
| NaCI | 120 |
| KCIの | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4・12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| グルコース | 11.5 |
