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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. マルチコンパートメントチップの調製とコーティング
- バイオセーフティキャビネットで、チップをペトリ皿またはその他の適切な滅菌容器に入れます。
- チップの左上のウェルに100μLのプレコーティング溶液を加え、メインチャネルを通って隣接するウェルに流します
手記：プレコーティング溶液は、マイクロ流体チャネルをプレコートするために使用され、チップ内に気泡が閉じ込められる可能性を排除します。
- 左下のウェルに100μLのプレコート溶液を充填します。溶液がマイクログルーブを流れるまで5分間待ちます。
- 100 μLのプレコーティング溶液を右上のウェルに加え、メインチャネルを通って隣接するウェルに流します。右下のウェルに100μLのプレコート溶液を充填します。
- 各ウェルから溶液を吸引します。メインチャネルから液体が除去されないように、メインチャネルから離して吸引します(図1A)。直ちに150 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を左上のウェルに加えます。待つ 1.5 分
注意：同封のメインチャネルからすべての液体を吸引しないでください。
- 左下のウェルに150μLのPBSを添加します。液体がマイクログルーブを流れるまで5分待ちます。150 μL PBSを右上のウェルに加えます。150 μL PBSを右下のウェルに加えます。10分待ちます。
- 手順1.5〜1.6を繰り返して、2回目のPBS洗浄を行います。
- 組織培養顕微鏡でチップをメインチャネルに気泡がないか確認します。気泡がある場合は、以下の手順を実行してください。気泡が存在しない場合は、手順 1.9 に進みます。
- PBSをウェルから吸引し、ピペットの先端をチャネル開口部から離します(図1A)。
- 100 μLのプレコーティング溶液を上部ウェルに分注し、ピペットの先端をチャネル開口部の近くに傾けます(図1B)。 気泡はチャネルを通って下部のウェルに移動するはずです。1.5分待ちます。
- 手順1.3〜1.8を繰り返します。
- PBSをウェルから吸引し、ピペットの先端をチャネル開口部から離します(図1A)。
- 0.5 mg/mL ポリ d-リジン (PDL) 100 μL をチップの左上のウェルに加えます。1.5分待ちます。左下のウェルに100 μLのPDLを充填します。
- 100 μLのPDLをチップの右上のウェルに加えます。1.5分待ちます。右下のウェルに100μLを加えます。
- シャーレを閉じ、チップを37°Cのインキュベーターに1時間置きます。
- PBS洗浄手順1.5〜1.6を2回繰り返して、余分なPDLを取り除きます。
- デバイスからPBSを吸引します。
- すぐに100μLの細胞培養培地をチップの左上のウェルに加えます。1.5分待ちます。左下のウェルにメディアを追加します。右上にメディアを追加します。1.5分待ちます。100 μLの培地をチップの右下のウェルに加えます。
- チップを37°Cのインキュベーターに置き、細胞をプレート化する準備が整います。
2. マルチコンパートメントチップへのニューロンのシード
- 確立されたプロトコルに従って解離ラット海馬ニューロンの細胞懸濁液を調製し、~12 × 106細胞/ mL.
の密度をもたらします。
手記：細胞懸濁液密度は3〜12×106細胞/mLの使用が可能です。より低い密度を使用すると、チップに添加される細胞懸濁液の量が増加する可能性があります。以下に説明する手順は、マウスの解離した皮質または海馬のニューロンに適用できます。他のニューロンタイプの最適な細胞密度は異なる場合があります。
- チップの各ウェル内の大部分の培地を取り除き、各ウェルに約5μLを残します。メインチャネルから液体が除去されないように、メインチャネルから離して吸引します(図1A).
注意：同封のメインチャネルから液体を吸引しないでください。メインチャネルから流体を吸引すると、気泡がチップに閉じ込められる可能性があります。
- 右上のウェルに5 μLの細胞懸濁液をロードし、右下のウェルにさらに5 μLの細胞懸濁液をロードします(合計~120,000細胞)。セルをメインチャネルの近くに分注してロードします(図1B)。顕微鏡で観察して、ニューロンがメインチャネルにあることを確認します。セルが付着するまで5分間待ちます。
手記：ニューロンはどちらのコンパートメントにもロードできます。説明のために、体細胞コンパートメントは右側のメインチャネルですが、どちらの区画も体細胞コンパートメントとして使用できます。チップあたり60,000個の細胞までの低細胞密度の使用が可能です。最大10μLの細胞懸濁液を、上述よりも細胞数が少ない細胞懸濁液と組み合わせて、体細胞コンパートメントの各ウェルに添加してもよい。
- 約150 μLの神経細胞培養培地を右上ウェルと右下のウェルにそれぞれ加え、次に150 μLの培地を左上ウェルと左下ウェルのそれぞれに添加します。チップを5% CO2 37°Cインキュベーターの加湿トレイに入れます。
- 24時間後、ウェルからメディアを取り出してメディア交換を行います。メインチャネルがいっぱいのままであることを確認してください。各上部ウェルに150 μLの培地を加え、下部ウェルを充填します。
- チップをインキュベーターに戻し、希望の日数
手記：メディアを数日ごとに監視して、淡いピンク色のままであることを確認します。メディアが黄色がかっている場合は、メディアの50%を新しいメディアと交換します。液面が低い場合は、適切な湿度を確保し、チップの適切な二次封じ込めを確保して、蒸発を防ぎます。二次封じ込めや、チップを含むディッシュをポリテトラフルオロエチレン(PTFE)-FEPフィルムで覆うことで、メディアの変更を最小限に抑えるか、排除することができます。
